Projekty realizowane dzięki wsparciu uzyskanemu z:


SYMFONIA

Mechanizmy farmakoterapeutyczne, markery spektroskopowe, i nanomechanika dysfunkcyjnego śródbłonka w stłuszczeniu wątroby i w niewydolności serca; w poszukiwaniu narządowej specyficzności

Kierownik: prof. dr hab. Stefan Karol Chłopicki
Kierownicy zespołów badawczych: prof. dr hab. Marek Szymoński, prof. dr hab. Małgorzata Anna Barańska
Źródło finansowania: Narodowe Centrum Nauki, Program SYMFONIA 3
Wnioskowane dofinansowanie: 6 996 680 PLN
Okres realizacji: 60 miesięcy 

Śródbłonek naczyniowy wyścielający układ krążenia od środka, jest dzisiaj postrzegany jako ważny narząd ustroju człowieka. Waży ok 1 kg, zajmuje 4000-7000 m2 powierzchni, i stanowi heterogenną grupę komórek odgrywającą fundamentalną rolę w regulacji układu krążenia i czynności narządów. Upośledzona czynność śródbłonka, poprzez działanie czynników ryzyka miażdżycy takich jak nadciśnienie, podwyższone stężenie cholesterolu, cukrzyca i inne prowadzi do  dysfunkcji śródbłonka i skutkiem tego do rozwoju blaszki miażdżycowej i jego klinicznych powikłań takich jak zawał mieśnia sercowego, udar mózgu czy choroby naczyń obwodowych. Stąd, dysfunkcje śródbłonka można uznać za barometr stanu układu krążenia a farmakoterapię śródbłonka za nowy sposób prewencji miażdżycy i jej powikłań. Dzisiaj istnieje już wiele dowodów na to, że dysfunkcji śródbłonka przyczynia się nie tylko do rozwoju miażdżycy, ale ma istotny udział w patogenezie wielu innych patologii jak stłuszczenia wątroby czy niewydolności mięśnia sercowego. W tych chorobach jednak dysfunkcja śródblonka nie jest pierwotną przyczyną chorób jak w miażdżycy (pierwotna dysfunkcja śródbłonka), ale raczej skutkiem uszkodzenia narządów przez proces chorobowy (wtórna dysfunkcja śródblonka). O ile coraz lepiej znane są mechanizmy pierwotnej dysfunkcji śródbłonka prowadzące do rozwoju i progresji blaszki miażdżycowej, to jednak mechanizmy wtórnej dysfunkcja śródbłonka są słabiej poznane. Celem projektu jest poszukiwanie mechanizmów komunikacji międzykomórkowej pomiędzy komórkami wątroby a komórkami śródbłonka naczyniowego w wątrobie oraz komórkami serca i komórkami śródbłonka w mięśniu sercowym, które to mechanizmy determinują fenotyp śródbłonka i mogą stać się podstawą do poszukiwania hepato- i kardioselektywnej terapii dysfunkcji śródbłonka. Stawiamy hipotezę ze dysfunkcja komórek śródbłonka zatok wątroby (LSEC) zależna od sygnałów z hepatocytów ma istotne znaczenie w rozwoju stłuszczenia wątroby, a dysfunkcja śródbłonka mikrokrążenia wieńcowego zależna od sygnałów z kardiomiocytów ma istotne znaczenie w rozwoju niewydolności serca.

Zastosowanie wielu komplementarnych i unikatowych metod badawczych in vitro, ex vivo oraz in vivo zaadaptowanych do badania czynności śródbłonka, które w ramach tego projektu będą znaczenie rozwinięte dzięki ekspertyzie interdyscyplinarnego zespołu pozwoli na lepsze zrozumienie mechanizmów rozwoju wtórnej dysfunkcji śródbłonka LCES i CMEC wymagających się klasycznej metodyce badawczej. Projekt również pozwoli na rozwój dziedziny obrazowania MRI in vivo w zakresie obrazowania śródbłonka i czynności mikrokrążenia, nanomechaniki struktur miękkich i szczotkowych w zastosowaniu do badania warstwy korowej śródbłonka i jego glikokaliksu, oraz spektroskopii ramanowskiej żywych komórek.


HARMONIA

Badania przeciwpłytkowego i przeciwzakrzepowego działania związków uwalniających tlenek węgla

Kierownik: prof. dr hab. Stefan Karol Chłopicki
Partner projektu: dr Roberto Motterlini, University Paris-Est, INSERM U955, Faculty of Medicine
Źródło finansowania: Narodowe Centrum Nauki, Program HARMONIA
Wnioskowane dofinansowanie: 1 222 182 PLN
Okres realizacji: 36 miesięcy

Tlenek węgla (CO) wykazuje działania naczyniorozszerzające, przeciwpłytkowe i przeciwzakrzepowe, lecz mechanizm leżący u podstaw tych aktywności farmakologicznych ciągle pozostaje niezbadany. Dotychczas niemożliwe było rozdzielenie przeciwpłytkowych i przeciwzakrzepowych efektów CO od działania hipotensyjnego i toksycznego CO. Nasze badania, przeprowadzone we współpracy z zespołem Prof. Roberto Motterlini’ego wykazały, że kinetyka uwalniania CO z CO-RMs ma istotny wpływ na farmakologiczne oddziaływanie tych związków na agregację płytek in vitro i procesy zakrzepowe in vivo. Celem tego projektu jest poszukiwanie mechanizmów które odpowiadają za działanie CO, przeciwpłytkowe in vitro i przeciwzakrzepowe in vivo. W szczególności celem projektu będzie: 1/ badanie kinetyki uwalniania CO ze znanych oraz z nowych CO-RMs w warunkach stresu oksydacyjnego; 2/ Scharakteryzowanie oddziaływania farmakologicznego nowych CO-RMs na płytki krwi i komórki śródbłonka naczyniowego w warunkach normoksji i hipoksji wraz z oceną zaangażowania cyklazy guanylanowej i mitochondriów w mechanizm działania tych związków; 3/ Zbadanie właściwości przeciwzakrzepowych CO-RMs w klasycznym modelu zakrzepicy tętniczej u szczurów oraz w najnowocześniejszym modelu zakrzepicy połączonym z przyżyciowym obrazowaniem konfokalnym w czasie rzeczywistym u myszy.


Opracowanie analizy spektroskopowej in vitro kropli lipidowych: ich biochemia i lokalizacja w odniesieniu do funkcji biologicznej

Kierownik: prof. dr hab. Małgorzata Anna Barańska
Partnerzy projektu: prof. Yukihiro Ozaki, School of Science and Technology, Kwansei Gakuin University, Japonia oraz prof. Jürgen Popp, Leibniz Institute of Photonic Technology, Jena, Niemcy
Źródło finansowania: Narodowe Centrum Nauki, Program HARMONIA
Wnioskowane dofinansowanie: 949 000 PLN
Okres realizacji: 36 miesięcy

Lipidy pełnią ważną rolę w organizmie, występują w komórkach, gdzie są składnikiem błon oraz w jej wnętrzu, gdzie np. magazynują energię lub przesyłają sygnały. Te wewnątrzkomórkowe skupiska zwane są kroplami lipidowymi i pomimo powszechnej obecności w komórkach prawie wszystkich organizmów, wiedza na temat ich funkcji, składu i mechanizmu powstawania jest wciąż znikoma. Nadmiar lipidów, zarówno w obiegu, jak i na poziomie tkanek, przyczynia się do zaburzenia zwanego dysfunkcją śródbłonka, które może być przyczyną wielu chorób metabolicznych, takich jak otyłość, miażdżyca tętnic i cukrzyca, oraz ich powikłań sercowo-naczyniowych. Ponieważ rola i skład kropli lipidowych w śródbłonku nie jest w pełni znana stąd celem projektu są pełne, kompleksowe badania tych organelli komórkowych, w warunkach normalnych i stymulujących stres i chorobę. Jako że wielkość kropli waha się w granicach od 20-40 nm do 100 mikrometrów, ich analiza in situ w komórkach wymaga zastosowania kompleksowej metody. Warunek ten spełnia spektroskopia oscylacyjna w postaci kilku technik. Nie wszystkie są dostępne w Polsce stąd potrzeba współpracy z partnerami zagranicznymi, którzy mają doświadczenie w badaniach lipidów w różnych modelach komórkowych.


OPUS

Nowe mechanizmy dysfunkcji śródbłonka u myszy E3L.CETP – unikatowym modelu hiperlipidemii z ludzkim profilem lipoprotein

Kierownik: prof. dr hab. Stefan Karol Chłopicki
Źródło finansowania: Narodowe Centrum Nauki, Program OPUS 15
Wnioskowane dofinansowanie: 1 887 200 PLN
Okres realizacji: 36 miesięcy 

Witamina K, należąca do witamin rozpuszczalnych w tłuszczach, odgrywa istotną rolę w regulacji procesów zakrzepowych oraz w procesach przebudowy kości poprzez mechanizmy regulowane przez białka zależne od witaminy K (VKD). Ostatnie badania epidemiologiczne wskazują, że spożywanie witaminy K2 – wywierającej głównie skutki pozawątrobowe (ale nie witaminy K1- wywierającej głównie skutki wątrobowe) – zmniejsza śmiertelność sercowo-naczyniową i całkowitą śmiertelność. Tego efektu nie można wytłumaczyć znanymi dzisiaj mechanizmami działania witaminy K2. Nasze wstępne wyniki wykazują po raz pierwszy na to, że witamina K2 podawana w małej dawce poprawia czynność śródbłonka u myszy z miażdżycą, mierzoną in vivo. Na podstawie naszych wstępnych wyników badań sądzimy, że upośledzenie endogennej syntezy witaminy K2 w śródbłonku przyczynia się do rozwoju dysfunkcji śródbłonka w miażdżycy, a suplementacja witaminy K2 odwraca deficyt endogennej witaminy K2 w śródbłonku, w konsekwencji poprawia status karboksylacji białek zależnych od witaminy K i poprawia czynność śródbłonka. Witamina K2 może odgrywać istotną rolę w regulacji czynności śródbłonka, która jak dotąd jest nieznana.

Zdumiewające jest, że pomimo długiej historii badań, wiedza dotycząca roli witaminy K w regulacji czynności śródbłonku jest znikoma, zarówno w kontekście fizjologii, biochemii, patofizjologii jak i farmakologii śródbłonka i wielu chorób związanych z dysfunkcją śródbłonka. Uzupełnienie tej wiedzy w ramach niniejszego projektu, może przynieść nie tylko nowe zrozumienie mechanizmów działania egzogennej witaminy K2, oraz regulacji czynności śródbłonka przez endogenną witaminę K2, ale może również otworzyć nowe perspektywy terapeutyczne wielu chorób przebiegających z dysfunkcją śródbłonka naczyniowego.

W projekcie wykorzystane zostaną myszy E3L.CETP, unikatowy model hiperlipidemii z ludzkim profilem lipoprotein, w którym dysfunkcja śródbłonka rozwija się powoli i znacznie wyprzedza rozwój miażdżycy. Lepsze zrozumienie mechanizmów rozwoju dysfunkcji śródbłonka w tym modelu pozwoli na rozwój badań nad nowymi mechanizmami farmakoterapeutycznymi dysfunkcji śródbłonka in vivo.


RS-SRS-MED: Mikroskopia spontanicznego i stymulowanego rozpraszania ramanowskiego do czułego i ultraszybkiego obrazowania komórek w procesie rozwoju chorób cywilizacyjnych

Kierownik: prof. dr hab. Małgorzata Anna Barańska
Partnerzy: Projekt realizowany wspólnie między Wydziałem Chemii UJ oraz Jagiellońskim Centrum Rozwoju Leków
Źródło finansowania: Narodowe Centrum Nauki, Program OPUS
Wnioskowane dofinansowanie: 1 896 400 PLN
Okres realizacji: 36 miesięcy

Choroby cywilizacyjne są coraz większym problemem w starzejących się społeczeństwach. Chociaż są one badane przez armię naukowców na całym świecie, wiele mechanizmów ich rozwoju jest nadal niejasna. Lepsza diagnostyka i skuteczna terapia mogłaby oprzeć się na wiedzy zgromadzonej na podstawie badań nad procesami biochemicznymi związanymi z postępem patologii i ich leczeniem na poziomie komórkowym, ale jest to bardzo trudne zadanie, ponieważ wymaga bardzo szybkich metod o wysokiej czułości i selektywności. Istnieje kilka modeli biologicznych dostępnych do badania procesów biochemicznych, np. zwierzęta(in vivo), tkanki (ex vivo) i komórki(in vitro). W projekcie planujemy wykorzystać modele zwierzęce chorób cywilizacyjnych, a pomiary prowadzić na tkankach i komórkach. W szczególności interesuje nas śródbłonek, którego dysfunkcja może prowadzić do rozwoju wielu chorób (w niektórych przypadkach obserwujemy wtórną dysfunkcję śródbłonka, jako efekt choroby).W projekcie deklarujemy opracowanie nowej metodologii badania szybkich procesów na poziomie subkomórkowym, w tym transportu makrocząsteczek. Transport makrocząsteczek w śródbłonku naczyniowym i jego modyfikacja, np. przez siły mechaniczne, jest ważna z punktu widzenia prawidłowego funkcjonowania tkanki zdrowej oraz w rozwoju różnych patologii. Wykorzystując spektroskopię, a więc metodę w której badamy oddziaływanie promieniowania z próbką, można w sposób niedestrukcyjny i kompleksowy uzyskiwać informacje o stanie biochemicznym próbek. Planujemy badać zmiany biochemiczne w komórkach przy użyciu metod spektroskopowych, przede wszystkim mikroskopii ramanowskiej -klasycznej(ang. RS, Raman scattering) i wymuszonego rozpraszania ramanowskiego (ang. SRS microscopy, stimulated Raman scattering) oraz modeli biologicznych -komórek konkretnych narządów (np. naczyń, serca, wątroby i mózgu) zwierząt z mysich modeli miażdżycy, stłuszczenia wątroby i choroby Alzheimera (próbki MEDyczne). Mikroskopia RS-SRS-MED. nie jest jeszcze dostępna w Polsce; więc planujemy ją zaprojektować, skonstruować i przetestować, i po raz pierwszy wykorzystać potencjał mikroskopii SRS razem z innymi technikami do analizy komórek różnych narządów. Zdecydowanie wierzymy, że mikroskopia RS-SRS-MED. będzie narzędziem, które pozwoli uzyskać nową wiedze, pomoże wskazać nowe markery chorób cywilizacyjnych, co przyniesie korzyść społeczeństwu, a także przyczyni się do alternatywnej diagnostyki i leczenia tych chorób.


Schwytać choroby cywilizacyjne na gorącym uczynku – spektroskopia Ramana in vivo

Kierownik: dr hab. Agnieszka Kaczor (Uniwersytet Jagielloński; Wydział Chemii)
Źródło finansowania: Narodowe Centrum Nauki, Program OPUS 9
Wnioskowane dofinansowanie: 907 320 PLN
Okres realizacji: 36 miesięcy

Spektroskopia Ramana jest z powodzeniem wykorzystywana do badań zmian biochemicznych w tkankach i komórkach w modelach in vitro oraz ex vivo. Modele te, choć niewątpliwie użyteczne, są oparte na pewnych ważkich założeniach: dotyczących braku wpływu nieobecności “otoczenia tkankowego” (w przypadku modeli komórkowych in vitro) i procedur utrwalania tkanek lub komórek na uzyskane wyniki, czy możności wnioskowania o rozwoju patologii u człowieka na podstawie wyników uzyskanych na zwierzętach. Ograniczenia metodologii ex vivo i in vitro wynikają także z faktu, iż na ogół w tego typu badaniach używane są zwierzęce modele knock-outów genowych lub modele, w których rozwój patologii następuje wskutek pojedynczego bodźca. Ograniczenia te są wyeliminowane w metodyce in vivo z użyciem sond światłowodowych, w przypadku której badana tkanka jest badana bezpośrednio w żyjącym organizmie. Spektroskopia ramanowska in vivo nie jest rozwijana w Polsce, choć jest z powodzeniem używana w wielu laboratoriach na świecie. W obliczu wzrastających zagrożeń związanych z chorobami cywilizacyjnymi, rozwijanie wiedzy o tych patologiach jest istotnym czynnikiem, który może przyczynić się do ich zapobiegania. Dlatego celem projektu jest zastosowanie spektroskopii Ramana in vivo (w rzeczywistych warunkach fizjologicznych) do badania i charakterystyki zmian chemicznych w tkankach z rozwiniętą patologią w stosunku do kontrolnych.


Indukowanie chiralności w supracząsteczkowych agregatach „gość-gospodarz” – rozwój nowych metod rezonansowej ramanowskiej aktywności optycznej

Kierownik: dr hab. Agnieszka Kaczor (Uniwersytet Jagielloński; Wydział Chemii)
Źródło finansowania: Narodowe Centrum Nauki, Program OPUS
Wnioskowane dofinansowanie: 1 126 560 PLN
Okres realizacji: 36 miesięcy

Spektroskopia rozproszenia ramanowskiego jest techniką badania materii, opartą na rejestracji fotonów nieelastycznie rozpraszanych przez badaną próbkę po naświetleniu jej światłem o pewnej energii. Ramanowska aktywność optyczna (ang. Raman Optical Activity, ROA) jest wariacją spektroskopii ramanowskiej, w której badana jest różnica intensywności rozpraszania ramanowskiego dla padającego i/lub rozproszonego światła kołowo spolaryzowanego w lewo- i prawoskrętnie. Różnica ta jest różna od zera  jedynie  w  przypadku  gdy  badane  indywiduum  (cząsteczka,  jon,  makrocząsteczka,  etc.)  jest chiralna.

Słowo chiralność pochodzi od greckiego słowa cheir, oznaczającego rękę i nawiązuje do pewnej jej cechy tj. niemożności nałożenia na siebie ręki (a właściwie dłoni) i jej odbicia lustrzanego. Wynika to z faktu istnienia dłoni w wersjach „prawa” i „lewa”. Podobnie niektóre cząsteczki, jony lub układy cząsteczek charakteryzują się chiralnością, czyli faktem, iż nie można ich nałożyć z obrazem lustrzanym. Indywidua chemiczne, które są swoimi odbiciami lustrzanymi nazywa się izomerami optycznymi. Chiralność jest bardzo istotna w przyrodzie, np. wiele kluczowych procesów metabolicznych jest chiralnych, m. in. dlatego, iż wiele cząsteczek biologicznych budujących organizmy żywe jest homochiralnych (czyli występujących jedynie w postaci jednego izomeru optycznego). Na przykład naturalnie występujące aminokwasy występują tylko w formie konfiguracji L, a naturalnie występujące cukry – w formie D. Nie tylko budowa cząsteczki może decydować o tym, iż materia jest chiralna. Chiralność może dotyczyć też układów cząsteczek, np. trzeciorzędowa struktura białek jest źródłem makrocząsteczkowej chiralności. Jednym z najbardziej kluczowych z punktu widzenia życia na Ziemi indywiduów chiralnych jest DNA. Źródłem supracząsteczkowej chiralności jest w tym przypadku skręt helisy, a przeważającą formą jest helisa prawoskrętna. Od pewnego czasu wiadomo, iż chiralność może być indukowana, np. chiralne otoczenie chemiczne, blokując rotację cząsteczki, może wymuszać jest pewną orientację w przestrzeni i sprawiać, iż staje się ona chiralna. Zjawiska indukcji chiralnej są niezwykle istotne, gdyż związane są z przekazywaniem chiralnej informacji i rozpoznawaniem chiralnym.  Mimo  iż  istnieją  metody  badania  chiralności,  np.  wspomniana  metoda  ROA,  czy elektronowy dichroizm kołowy (ang. Electronic Circular Dichroism, ECD), lub wibracyjny dichroizm kołowy (ang. Vibrational Circular Dichroism, VCD), mają one pewne ograniczenia. W szczególności powszechnie stosowanej metodzie ECD brak specyficzności konformacyjnej, tj. nie rozpoznaje ona zbyt dobrze różnych konformerów cząsteczek. Natomiast wibracyjny dichroizm kołowy oraz ROA są metodami   o  stosunkowo   małej  czułości.   

Aby  poprawić   czułość  metody  ROA,   możliwe   jest zastosowanie wzmocnienia rezonansowego, które następuje, gdy indywiduum chemiczne absorbuje energię w zakresie zbliżonym do energii stosowanego światła wzbudzającego, a ponadto gdy absorbcja ta jest związana z układem chiralnym. Wówczas możliwa jest bardzo duża poprawa czułości metody, jak np. zademonstrowaliśmy to dla supracząsteczkowych agregatów karotenoidów w mieszanych rozpuszczalnikach [G. Zajac, A. Kaczor, A. Pallares Zazo, J. Mlynarski, M. Dudek, M. Baranska, J. Phys. B, 2016, 120, 4028]. Ponadto, silny sygnał chiralny, obserwowany w takich agregatach sprawił, iż możliwa była obserwacja indukowanej chiralności w cząsteczkach rozpuszczalnika, które same w sobie są achiralne. W ramach przedłożonego projektu planowane jest otrzymanie i badanie (z użyciem ROA, VCD i ECD) supramolekularnych układów, w których następuje indukcja chiralności. Planowane jest badanie  różnych  supracząsteczkowych  układów  tego  typu,  opartych  na  licznych  kombinacjach cząsteczek chiralnych/achiralnych i tak dobranych strukturalnie, aby uzyskiwany sygnał ROA był wzmocniony rezonansowo.


Stopień nienasycenia lipidów w okołonaczyniowej tkance tłuszczowej – nowy biomarker w zapaleniu ściany naczynia? Badania ramanowskie w mysich modelach chorób krążenia i izolowanych pierwotnych adipocytach[więcej]

Kierownik: dr hab. Agnieszka Kaczor (Uniwersytet Jagielloński; Wydział Chemii)
Źródło finansowania: Narodowe Centrum Nauki, Program OPUS 17
Wnioskowane dofinansowanie: 1 766 880 PLN
Okres realizacji: 36 miesięcy

Okołonaczyniowa tkanka tłuszczowa (pVAT) otacza wszystkie naczynia krwionośne z wyjątkiem naczyń mózgowych. Wiadomo już, że pVAT wykazuje ogromną aktywność endokrynną i może wywierać znaczący wpływ na naczynie krwionośne m. in. przez uwalnianie tlenku azotu, angiotensyny, leptyny, czy adiponektyny. Dysfunkcyjny pVAT wytwarza wiele prozapalnych adipokin, cytokin i chemokin i w znacznym stopniu uczestniczy w rozwoju chorób układu krążenia. Nic więc dziwnego, że pVAT jest potencjalnym nowym celem terapeutycznym w zakresie profilaktyki i leczenia chorób układu krążenia. Nie zbadano jednak zmian chemicznych w pVAT w trakcie rozwoju patologii układu krążenia, częściowo ze względu na brak odpowiedniej metodologii. Podstawowym celem projektu jest zbadanie zmian chemicznych pVAT w różnych lokalizacjach naczyniowych w różnych modelach modelowych patologii układu krwionośnego w celu znalezienia markerów chemicznych pVAT oraz stanu zapalnego naczyń krwionośnych, co potencjalnie może umożliwić prognozowanie ryzyka sercowo-naczyniowego. Zakładamy, że stopień nienasycenia lipidów może być prawdopodobnym markerem dysfunkcji pVAT o potencjalnym zastosowaniu diagnostycznym.


W poszukiwaniu biochemicznych, mechanicznych i funkcjonalnych markerów stresu oksydacyjnego w erytrocytach

Kierownik: dr Katarzyna Marzec
Członkowie zespołu badawczego: dr Katarzyna Bułat, mgr Aneta Blat, mgr Mateusz Mardyła
Źródło finansowania: Narodowe Centrum Nauki, Program OPUS 12
Wnioskowane dofinansowanie:  1 239 900 zł PLN
Okres realizacji: 36 miesięcy

Reaktywne formy tlenu (ROS), reaktywne formy azotu (RNS), a także inne rodzaje wolnych rodników mogą mieć szkodliwy wpływ na organizmy na poziomie komórkowym, jednakże ich wytwarzanie jest również fizjologicznym procesem niezbędnym dla wielu reakcji metabolicznych.

Krew odgrywa szczególną rolę w mechanizmie stresu oksydacyjnego, gdyż usuwa szkodliwe produkty, w tym wiele czynników utleniających. Podstawą projektu jest zbadanie zmian wywołanych w erytrocytach, co jest nietypowym podejściem do zagadnienia stresu oksydacyjnego. Wcześniejsze badania w tym zakresie skupiały się głównie na innych frakcjach krwi, głównie krwinkach białych. Wiedza na temat zmian w erytrocytach jest znacznie uboższa, co uzasadnia potrzebę poszerzenia wiedzy podstawowej właśnie w tym zakresie. Informacja na temat markerów stresu oksydacyjnego zmierzonych in situ w erytrocytach może odzwierciedlać poziom stresu oksydacyjnego w krwi, jak również może stanowić potencjalny biomarker ogólnego poziomu stresu oksydacyjnego w organizmie, co byłaby niezwykle przydatne w badaniach nad progresją chorób cywilizacyjnych. Erytrocyty wykazują uszkodzenia oksydacyjne poprzez charakterystyczne zmiany w rozmiarze, kształcie i morfologii komórki, jak również zmiany biochemiczne, strukturalne i funkcjonalne. Wszystkie te parametry mają wpływ lub są związane ze zmianami w innych frakcji krwi i jej ogólnych właściwości, takich jak zwiększonej lepkości i zaburzenie przepływu. Dlatego też, celem projektu jest kompleksowa ocena stresu oksydacyjnego na poziomie erytrocytów z wykorzystaniem innowacyjnej technologii. Zastosowanie kombinacji technik takich jak spektroskopii ramanowskiej (RS), spektroskopii absorpcyjnej w podczerwieni (FT-IR) oraz mikroskopii sił atomowych (AFM) wraz z uzupełnieniem o techniki referencyjne (UV-Vis, pomiary parametrów biochemicznych, barwienia, gazometria krwi, ektocytometria) dostarczy nowej wiedzy na temat biochemicznych, mechanicznych i funkcjonalnych markerów poziomu stresu oksydacyjnego w erytrocytach.

Badania można podzielić na trzy etapy:

  1. Charakterystyka indukowanego stresu oksydacyjnego in situ w izolowanych erytrocytach pobranych od zwierząt kontrolnych, która umożliwi detekcję biochemicznych, mechanicznych i funkcjonalnych markerów dla zmian: hemoglobiny, lipidów i białek wewnątrz błony komórkowej erytrocytów, właściwości mechanicznych, takich jak sztywność i topografia komórki; właściwości funkcjonalnych, takich jak odkształcalność i agregacja oraz biochemicznych dla treści pęcherzyków wydzielniczych produkowanych przez erytrocyty.
  1. Definicja i opis możliwych biochemicznych, mechanicznych i funkcyjnych markerów stresu oksydacyjnego erytrocytów dla typu induktora wywołującego uszkodzenie, rodzaju erytrocytów (izolowane od zdrowych myszy kontrolnych oraz od mysiego modelu stresu oksydacyjnego) oraz dla izolowanych erytrocytów versus erytrocytów w pełnej krwi.
  1. Badania RS/IR/AFM na wybranych markerach i ocena poziomu stresu oksydacyjnego in vitro/ex vivo dla erytrocytów pobranych od modeli mysich chorób cywilizacyjnych, które współdzielą ścieżkę etiologiczną, w której stres oksydacyjny odgrywa ważną rolę, takich jak mysi model cukrzycy, miażdżycy czy przerzutowości nowotworowej.

Na podstawie danych literaturowych oraz naszych wstępnych wyników można wnioskować, że wykorzystanie w projekcie kombinacji technik spektroskopii ramanowskiej, IR i AFM, uzupełnionych o techniki referencyjne, umożliwi nie tylko jakościowo nowy opis poziomu stresu oksydacyjnego w erytrocytach, ale również może stanowić innowacyjny zestaw technik do jego łatwiejszej detekcji i opisu. Spektroskopia RS wykorzystuje zalety immersyjnej spektroskopii konfokalnej, jak również umożliwia na otrzymanie informacji dotyczących biochemicznych zmian w próbce na poziomie molekularnym. Spektroskopia IR, że nie tylko umożliwia wykrycie zmian jakościowych, ale również łatwe ilościowe oznaczenie wielu zmian biochemicznych. Obie techniki, mają ogromny potencjał diagnostyczny także w badaniach erytrocytów. AFM może dostarczyć informacji na temat mechanicznych markerów uszkodzenia komórek nawet z pojedynczego ogniwa zmian patologicznych, również w przypadku erytrocytów, co sprawia, że to obiecująca metoda w diagnostyce stresu oksydacyjnego. Co więcej, techniki te umożliwiają przeprowadzenie analizy na niewielkiej ilości krwi. Uzyskane dane komputerowe (zbiór widm, map i obrazów – Ramana/IR/AFM), które przechowują informacje molekularną, strukturalną, biochemiczną i mechaniczną, mogą być przechowywane do dalszej analizy.

Projekt bezpośrednio umożliwi na poszerzenie obecnej wiedzy dotyczącej zmian w erytrocytach na skutek stresu oksydacyjnego i stworzenie bardzo unikalnej grupy badawczej, która wykorzystuje nowe zastosowania technologii opartej na technikach spektroskopowych i obrazowania do analizy erytrocytów, jak również prezentuje nową koncepcję badania stresu oksydacyjnego. Otrzymane wyniki zostaną opublikowane w międzynarodowych czasopismach o wysokim czynniku wpływu, i prezentowane na konferencjach międzynarodowych i polskich. Dodatkowo projekt przyczyni się do stworzenia metodologii pomiaru poziomu stresu oksydacyjnego w erytrocytach opartej na innowacyjnej kombinacji technik IR /RS/AFM co może zostać użyte do badań modeli mysich chorób cywilizacyjnych.


Spektrohistopatologia FTIR and immunoSERS w identyfikacji stanu biochemicznego mikroprzerzutów i niszy pre-metastatycznej w mysim modelu nowotworu sutka

Kierownik: dr hab. Kamilla Małek (Uniwersytet Jagielloński; Wydział Chemii )
Koordynacja ze strony JCET jako partnera:
Źródło finansowania: Narodowe Centrum Nauki, Program OPUS
Wnioskowane dofinansowanie:  1 011 050 PLN
Okres realizacji: 36 miesięcy

Projekt zatytułowany „Spektrohistopatologia FTIR and immunoSERS w identyfikacji stanu biochemicznego mikroprzerzutów i niszy premetastatycznej w mysim modelu nowotworu sutka” ma na celu „pobranie odcisku palca” przerzutu nowotworowego zanim on się w pełni rozwinie. Jak ogólnie wiadomo, rak jest najbardziej śmiertelną chorobą na świecie i pomimo ciągłego wprowadzania nowych metod diagnostycznych i strategii terapeutycznych, liczba nowych przypadków choroby oraz zgonów ciągle wzrasta. Prognozuje się że 50% nowych przypadków zachorowań wśród kobiet i mężczyzn będzie dotyczyć raka piersi/prostaty, płuc, oskrzeli i odbytu, z czego aż 20% przypisuje się nowotworowi piersi. Ale nowotwór pierwotny nie jest główną przyczyną zgonów, tylko jego przerzut. Proces ten odbywa się poprzez rozsiew komórek nowotworowych do naczyń krwionośnych i limfatycznych, ich transport przez krążenie systemowe do odległych narządów a następnie kolonizację i utworzenie mikroprzerzutu rozmnażającego się do makrometastazy. Z kolei wiadomo również, że miejsce przerzutu nie jest przypadkowe tylko dany narząd  odbiera  sygnał  chemiczny  od  guza  pierwotnego  aby  „przygotować”  swoją  matrycę tkankową na przyjęcie niechcianego gościa, czyli utworzyć tak zwaną niszę pre-metastatyczną.


Projektowanie nanoczujników SERS dla detekcji ex vivo stanu zapalnego naczyń krwionośnych

Kierownik: dr hab. Kamilla Małek (Uniwersytet Jagielloński; Wydział Chemii )
Koordynacja ze strony JCET jako partnera:
Źródło finansowania: Narodowe Centrum Nauki, Program OPUS
Wnioskowane dofinansowanie:  861 660 PLN
Okres realizacji: 36 miesięcy

Detekcja biomolekuł poprzez rejestrację zjawiska wynikającego z oddziaływania światła i indywiduum chemicznego jest jednym z najbardziej obiecujących kierunków rozwoju czujników diagnostycznych. Oferują one wysoką czułość w połączeniu z nieinwazyjną naturą analizy i zaimplementowania ich w przenośne urządzenia. Zasadniczym celem projektu jest opracowanie nowej i czułej technologii opartej na połączeniu wysoce selektywnego immunochemicznego wykrywania biomarkerów stanu zapalnego naczyń krwionośnych z unikalnych profilem widma uzyskanego przy użyciu powierzchniowo wzmocnionej spektroskopii ramanowskiej (SERS). SERS jest wysoce czułą techniką detekcyjną opartą na nanostrukturalnych podłożach złota uzyskanych w reakcji chemicznej (nanocząstki metalu takie jak nanogwiazdy, nanomuszle) oraz na przykład w procesach anodyzacji i fotoredukcji podłoży aluminiowych czy tlenku tytanu dostarczając periodycznie ułożone nanostruktury (na przykład heksagonalne). SERS ma szerokie zastosowania, w różnorodnych dziedzinach jak w biomedycznej diagnostyce i badań biochemicznych oraz wykazuje ogromny potencjał w analizie multipleksowej, co czyni go szczególnie ważnym narzędziem do jednoczesnego diagnozowania wielu markerów choroby. Ogólnym celem projektu jest skonstruowanie dwóch rodzajów bioczujników do oznaczenia markerów zapalenia w naczyniach krwionośnych w przekroju tkanki i w osoczu krwi. Jeden z nich zapewni multipleksowe obrazowanie kilku antygenów w tętnicach miażdżycowych, podczas gdy drugi biosensor SERS typu „kanapkowego” posłuży ilościowemu oznaczaniu cytokin prozapalnych w osoczu krwi. Planowane badania mają więc charakter międzydziedzinowy łączący nanotechnologię materiałową, bardzo czułą technikę spektroskopową i technologię medyczną.


Spektroskopia ramanowska w badaniach in vitro wpływu chemioterapeutyków na komórki śródbłonka

Kierownik: dr hab. Kamilla Małek (Uniwersytet Jagielloński; Wydział Chemii)
Koordynacja ze strony JCET jako partnera:
Źródło finansowania: Narodowe Centrum Nauki, Program OPUS
Wnioskowane dofinansowanie:  861 660 PLN
Okres realizacji: 36 miesięcy

Wczesne rozpoznanie choroby ma kluczowe znaczenie, jeśli ludzie mają mieć dużą szansę odzyskania zdrowia lub przeżycia. W początkowych stadiach choroby stężenia biomarkerów specyficznych dla niej są śladowe a przecież obecne w bardzo złożonych próbkach biologicznych takich jak tkanka czy osocze krwi. Wykrycie tych markerów jest podobne do szukania igły w stogu siana, na poziomie którego obecnie stosowane metody diagnostyczne nie mogą wykryć. Zmiany stylu życia związane z urbanizacją, paleniem papierosów czy otyłością znacznie zwiększają liczbę osób narażonych na miażdżycę i chorobę wieńcową. Miażdżyca coraz częściej występuje już u młodych ludzi i jest główną przyczyną chorób układu krążenia które prowadzą do zawału serca, udaru mózgu lub śmierci. Powierzchniowo wzmocniona spektroskopia ramanowska (SERS) jest doskonałym narzędziem, które jest w stanie zidentyfikować i oznaczyć bardzo niskie stężenie białek markerowych, zwłaszcza w połączeniu z reakcją immunochemiczną.

Projekt ma na celu skonstruowanie bioczujników SERS do wykrywania śladowych ilości markerów chorobowych poprzez dopasowanie ich jak w modelu klucz do zamka. Aby osiągnąć taki poziom detekcji wymagane jest wytworzenie zaawansowanych nanomateriałów o uporządkowanych kształcie jak na przykład muszli, gwiazdy czy plastra miodu. Następnie działanie zaprojektowanych nanoczujników będzie ocenione w modelach zwierzęcych ludzkich chorób wynikających ze stanu zapalnego naczyń krwionośnych.


Rola N-metylotransferazy nikotynoamidowej (NNMT) i mechanizmów mitochondrialnych w dysfunkcji śródbłonka

Kierownik: prof. dr hab. Krzysztof Olaf Zabłocki (Instytut Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego Polskiej Akademii Nauk)
Koordynacja ze strony JCET jako partnera: prof. dr hab. Stefan Karol Chłopicki
Źródło finansowania: Narodowe Centrum Nauki, Program OPUS
Wnioskowane dofinansowanie:  1 415 832 zł PLN
Okres realizacji: 36 miesięcy

Dysfunkcja śródbłonka naczyniowego towarzyszy większości chorób człowieka, będąc ich pierwotną przyczyną lub następstwem patologii narządów. Skutkiem dysfunkcji śródbłonka w cukrzycy są makro- i mikro-angiopatie układu sercowo-naczyniowego prowadzące do zawału serca, nefropatii, czy retinopatii cukrzycowej. Pomimo intensywnych badań mechanizmy biochemiczne i molekularne leżące u podstaw dysfunkcji  śródbłonka  nie  są  w  pełni  wyjaśnione.  Jednym  z  czynników  wpływających  na  prawidłową funkcję  śródbłonka  może  być  N-metylotransferaza  nikotynoamidowa  (NNMT),  i  produkt  katalizowanej przez ten enzym reakcji metylacji nikotynamidu, 1- metylonikotynamid (MNA). Związek ten podawany egzogennie wykazuje działanie przeciwzakrzepowe, przeciwzapalne i naczynioprotekcyjne. Nieznana jest jednak funkcja endogennego MNA powstającego w komórkach śródbłonka. NNMT wykorzystuje jako substrat amid kwasu nikotynowego (NA), który jest także prekursorem NAD+,   co sprawia, że enzym ten wpływa na pulę dinukleotydów nikotynamidoadeninowych, a zatem pośrednio na metabolizm energetyczny mitochondriów i komórek i aktywność enzymów zależnych od NAD+  np. sirtuin.  Stawiamy hipotezę , że zwiększona aktywność NNMT w komórkach śródbłonka w warunkach stresu ma działanie cytoprotekcyjne poprzez stabilizację (stymulację) aktywności sirtuin. Celem niniejszego projektu jest zbadanie roli jaką pełni NNMT w odpowiedzi komórek śródbłonka w różnych modelach stresu komórkowego,  w  tym  w  obecności  palmitynianu  indukującego  insulinooporność,  po  traktowaniu TNFa wywołującym odpowiedź zapalną, w obecności czynników o działaniu genotoksycznym, a także w warunkach stresu metabolicznego i oksydacyjnego.


Rola Rnazy Mcpip1 w upośledzonym funkcjonowaniu śródbłonka towarzyszącym niealkoholowej stłuszczeniowej chorobie wątroby

Kierownik: dr Jerzy Kotlinowski (Zakład Biochemii Ogólnej
Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii, Uniwersytet Jagielloński)

Koordynacja ze strony JCET jako partnera: prof. dr hab. Stefan Karol Chłopicki
Źródło finansowania: Narodowe Centrum Nauki, Program OPUS
Wnioskowane dofinansowanie:  … PLN
Okres realizacji: 36 miesięcy

Celem projektu jest określenie roli, jaką pełni białko MCPIP1 w aktywacji i uszkodzeniu komórek śródbłonka w patogenezie niealkoholowej stłuszczeniowej chorobie wątroby (NAFLD). MCPIP1 należy do grupy kluczowych białek odpowiedzialnych za negatywną regulację odpowiedzi zapalnej. Hipoteza badawcza zakłada, że warunkowe wyłączenie genu kodującego białko MCPIP1 w leukocytach linii mieloidalnej, bądź w hepatocytach zainicjuje produkcję cytokin prozapalnych przez te komórki zmieniając tym samym funkcję i strukturę endotelium, przyczyniając się w ten sposób do progresji symptomów NAFLD. Planowane eksperymenty pozwolą na zbadanie nowych mechanizmów zaangażowanych w funkcjonowanie komórek śródbłonka jak również wykazanie istotnej roli MCPIP1 w biologii endotelium może przyczynić się do opracowania nowych terapii medycznych. Związki, które hamują degradację MCPIP1 mogą być w przyszłości wykorzystane do projektowania nowych leków stosowanych w terapii przewlekłego stanu zapalnego.


SONATINA

Badanie procesu zapalnego komórek śródbłonka in situ w izolowanych funkcjonalnych naczyniach krwionośnych z wykorzystaniem obrazowania ramanowskiego, mikroskopii sił atomowych i cytometrii obrazowej

Kierownik: dr inż. Marta Pacia
Wykonawcy:
Źródło finansowania: Narodowe Centrum Nauki, Program SONATINA 1
Wnioskowane dofinansowanie: 688 346 PLN
Okres realizacji: 36 miesięcy 

Niniejszy projekt zakłada pomiary komórek śródbłonka in situ w izolowanych funkcjonalnych naczyniach krwionośnych. Oznacza to, że po wypreparowaniu naczynia krwionośnego z organizmu myszy, nieutrwalone fragmenty otwartego naczynia krwionośnego umieszczane są w medium podtrzymującym funkcjonalność komórek śródbłonka, a następnie poddawane są eksperymentom. Projekt zakłada wykorzystanie szeregu technik badawczych: wysokorozdzielczego obrazowania ramanowskiego, pomiary widm ramanowskich z wykorzystaniem próbników światłowodowych, obrazowanie topografii,, fazy i amplitudy mikroskopią sił atomowych (AFM), wyznaczanie sztywności na podstawie pomiarów krzywych siła–odległość AFM oraz badań biologicznych.

Całościowe opracowanie otrzymanych wyników pozwoli na kompleksowe scharakteryzowanie markerów stanu zapalnego komórek śródbłonka in situ w izolowanych funkcjonalnych naczyniach krwionośnych, przykładowo pojawienie się ciałek lipidowych (obrazowanie ramanowskie), zwiększenie sztywności komórek śródbłonka (krzywe siła-odległość AFM) i zmniejszenie ilości wydzielanego tlenku azotu(II). Wyniki projektu przyczynią się do lepszego poznania procesu zapalnego, a pomiary komórek śródbłonka in situ w izolowanych funkcjonalnych naczyniach krwionośnych zapewnią naturalne środowisko. Farmakologia śródbłonka w wybranym modelu zapalenia pozwoli na określenie skuteczności działania wybranego leku i jego wpływ na zdefiniowane wcześniej cechy charakterystyczne stanu zapalnego.


SONATA

Spektroskopia ramanowska w badaniach in vitro wpływu chemioterapeutyków na komórki śródbłonka

Kierownik: dr Katarzyna Bożena Majzner
Źródło finansowania: Narodowe Centrum Nauki, Program SONATA
Wnioskowane dofinansowanie: 616 600 PLN
Okres realizacji: 36 miesięcy 

Celem projektu zatytułowanego „Spektroskopia ramanowska w badaniach in vitro nad wpływem wybranych chemioterapeutyków na komórki śródbłonka” jest zbadanie z zastosowaniem wieloparametrowej metodyki wykorzystującej konfokalną spektroskopię ramanowską, spektroskopię absorpcyjną w podczerwieni, mikroskopię sił atomowych (AFM) oraz oznaczeń biochemicznych do równoczesnej oceny wpływu na komórki śródbłonka leków przeciwnowotworowych podawanych dożylnie   pacjentom   onkologicznym.   W   ramach   projektu   planowane   jest   zbadanie   wpływu toksycznego działania szeregu rutynowo stosowanych w onkologii cytostatyków na komórki śródbłonka naczyniowego. Toksyczność to cecha cytostatyków polegająca na powodowaniu zaburzeń funkcji lub śmierci komórek żywych wskutek kontaktu z nimi i jest to działanie niepożądane wynikające z reakcji chemicznych/fizykochemicznych pomiędzy związkiem chemicznym a układem biologicznym (np. DNA, enzymy).


Badania strukturalne i obrazowanie chemiczne witaminy A i E oraz ich metabolitów w zdrowych i patologicznie zmienionych tkankach zwierzęcych

Kierownik: dr Katarzyna M. Marzec
Wykonawcy: dr Chruszcz-Lipska Katarzyna, dr Maślak Edyta, mgr Kamila Kochan
Źródło finansowania: Narodowe Centrum Nauki, Program SONATA 4
Wnioskowane dofinansowanie: 362 380 PLN
Okres realizacji: 36 miesięcy 

Podstawowym celem pracy jest określenie in situ dystrybucji witamin A, E oraz ich metabolitów w wybranych tkankach mysich. Pierwszy etap badań dotyczy próbek biologicznych osobników zdrowych pobranych z różnych organów (wątroba, płuca, mózg, nerki, aorta). Drugi, tkanek pobranych z oragnów zmienionych chorobowo. Badania będą prowadzone przy pomocy obrazowania ramanowskiego oraz IR. W celu weryfikacji/potwierdzenia danych planuje się również barwienia histologiczne. Analiza strukturalna oraz konformacyjna tytułowych związków pozwoli na odnalezienie „spektroskopowych pasm markerowych”, które umożliwią analizę obrazowania próbek biologicznych. Stosowane w projekcie techniki podzielić można na metody eksperymentalne (IR, RS) oraz kwantowo-chemiczne metody teoretyczne (głównie DFT).


Opracowanie metodyki tlenometrii EPR do oceny śródbłonkowego działania leków

Kierownik i wykonawca: dr Patrycja Kaczara
Źródło finansowania: Narodowe Centrum Nauki, Program SONATA 3
Wnioskowane dofinansowanie: 391 482 PLN
Okres realizacji: 36 miesięcy 

Śródbłonek naczyń krwionośnych pełni ważną rolę w utrzymaniu homeostazy naczyń w warunkach fizjologicznych oraz patologicznych. Wyniki badań wstępnych wykazały, że stan zapalny u myszy spowodował znaczne obniżenie szybkości konsumpcji tlenu przez skrawki wyizolowanych naczyń krwionośnych, a efekt mógł być regulowany farmakologicznie. Większość rodzajów komórek zużywa tlen podczas oddychania mitochondrialnego w celu wyprodukowania energii w procesie fosforylacji oksydacyjnej. Jednakże komórki śródbłonka do produkcji ATP wykorzystują w znacznej mierze glikolizę, a dokładniej proces nazwany glikolizą tlenową, nawet w obecności wystarczającej ilości tlenu. Ta nietypowa własność śródbłonka jest prawdopodobnie wynikiem adaptacji do środowiska o wysokiej zawartości tlenu, a udział glikolizy tlenowej w stosunku do fosforylacji oksydacyjnej może silnie zależeć od fizjologicznych lub patologicznych warunków. Sposób pozyskiwania przez komórki energii może być bardzo czułym parametrem pozwalającym na ocenę odpowiedzi komórek na różne korzystne lub szkodliwe czynniki.

Dlatego głównym celem  proponowanych badań jest opracowanie i optymalizacja opartej o spektroskopię elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) metodologii pomiaru oddychania komórek śródbłonka in vitro lub izolowanych mysich naczyń krwionośnych ex vivo w warunkach fizjologicznych lub patologicznych. Drugim celem badań jest ocena, przy użyciu opracowanej metody, zmian aktywności procesów glikolizy i oksydacyjnej fosforylacji w odpowiedzi na czynniki prozapalne lub inne rodzaje stresu komórkowego. Opracowana metodologia będzie także pomocną w badaniach nad rolą nowych, farmakologicznie aktywnych związków,  jak CORM, mildronian czy trimetazydyna na oddychanie i stres oksydacyjny w komórkach śródbłonka.


ETIUDA

Badania kompleksów wybranych hemoprotein i ich przemian w układach biologicznych metodami spektroskopii molekularnej

Kierownik: mgr Jakub Stanisław Dybaś
Źródło finansowania: Narodowe Centrum Nauki, Program ETIUDA
Wnioskowane dofinansowanie: 115 676 PLN
Okres realizacji: 12 miesięcy

Hemoproteiny tworzą grupę białek, których grupą prostetyczną jest hem, połączenie kationu żelaza (FeII) i porfiryny (protoporfiryny IX). Najbardziej rozpowszechnioną z hemoprotein jest hemoglobina (Hb), białko występujące w erytrocytach, pełniące funkcję transportera gazów oddechowych (O2  i CO2) oraz biorące udział w utrzymaniu regulacji kwasowo-zasadowej. Obok Hb najważniejszymi przykładami hemoprotein są mioglobina (Mb), występująca w mięśniach jako magazyn O2, oraz cytochrom c, transporter elektronów w łańcuchu oddechowym zachodzącym w mitochondriach. Różnice w pełnionych funkcjach pomiędzy wymienionymi wyżej hemoproteinami znajdują swoje odzwierciedlenie w ich budowie. Zarówno w cząsteczkach Hb jak i Mb grupę prostetyczną stanowi hem b. W odróżnieniu jednak do Hb, której białkowa część złożona jest z czterech podjednostek, mioglobina zbudowana jest tylko z jednej. Przekłada się to na wyższe powinowactwo tlenu do Mb1  co jest zrozumiałe ze względu na pełnioną funkcję – jako magazyn dla tlenu, Mb musi chętniej wiązać, a trudniej odłączać O2  niż dostarczająca go Hb. Cytochrom c jest najmniejszym białkiem wśród opisywanych hemoprotein o znikomym powinowactwie do O2, którego łańcuch polipeptydowy jest połączony z hemem c za pośrednictwem dwóch mostków tioeterowych, co stanowi znaczącą różnicę w porównaniu do Mb i Hb, gdzie hem b związany jest z globiną wiązaniem koordynacyjnym poprzez kation żelaza. Cechą wspólną opisywanych hemoprotein jest obecność centralnie ulokowanego jonu żelaza o sześciu miejscach koordynacyjnych. Pięć z nich, jest najczęściej zajętych przez wiązania Fe z atomami azotu (cztery pochodzące od pierścieni pirolowych a jedno od azotu imidazolowego pierścienia histydyny). Ostatnie, szóste miejsce koordynacyjne, pozostaje wolne, i w zależności od hemoproteiny może stać się miejscem związania różnego podstawnika – O2, CO, NO, histydyny lub innego aminokwasu, tworząc kompleks hemoproteiny.


PRELUDIUM

Rola reaktywnych form tlenu (ROS) produkowanych podczas maksymalnego wysiłku przez śródbłonkowe enzymy NOX2 i NOX4 w regulacji powysiłkowego stresu oksydacyjnego, powysiłkowej hemostazy oraz wydolności wysiłkowej

Kierownik: mgr Kamil Przyborowski
Źródło finansowania: Narodowe Centrum Nauki, Program PRELUDIUM
Wnioskowane dofinansowanie: 119 940 PLN
Okres realizacji: 24 miesiące

Niniejszy projekt ma na celu uzupełnić wiedzę na temat roli ROS generowanych podczas jednorazowego maksymalnego wysiłku przez śródbłonkowe enzymy NOX2 i NOX4 (z ang. Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate (NADPH) Oxidase (NOX)) w powysiłkowym stresie oksydacyjnym i adaptacji/maladaptacji śródbłonka, a także w regulacji wydolności wysiłkowej oraz powysiłkowych parametrów hemostatycznych/zakrzepowych przy użyciu unikatowych modeli zwierzęcych (myszy genetycznie zmodyfikowane typu knock-out (KO) enzymów NOX selektywnie w śródbłonku).

Reaktywne formy tlenu (z ang. Reactive Oxygen Species, ROS) jako produkty uboczne metabolizmu powstające w wyniku redukcji tlenu stanowią szeroką grupę cząsteczek o różnej reaktywności, np.: anionorodnik ponadtlenkowy (•O2-), nadtlenoazotyn (HONOO-) oraz nadtlenek wodoru (H2O2). Ich nadmierna produkcja w ilościach znacznie przekraczających zdolności eliminacji przez naturalne endogenne mechanizmy antyoksydacyjne lub powstawanie w nietypowych fizjologicznie miejscach określane są mianem stresu oksydacyjnego. Stres oksydacyjny może być przyczyną uszkodzenia struktur komórkowych, białek, lipidów oraz DNA i towarzyszy wielu jednostkom chorobowym. Z drugiej strony, ROS są również ważnymi cząsteczkami w regulacji procesów fizjologicznych. Wśród źródeł powstawania ROS możemy wyróżnić: NADPH oksydazy (NOX), oksydazę ksantynową (z ang. xanthine oxidase, XO), syntazę tlenku azotu (NOS) oraz mitochondrialny łańcuch oddechowy.

Wykonywanie wysiłku fizycznego wiąże się ze zwiększoną produkcją ROS. Jak wskazują dane literaturowe powstające w wysiłku ROS pośredniczą w prozdrowotnych efektach regularnego wysiłku poprzez uruchomienie wielu mechanizmów adaptacyjnych. Jednak powstające w nadmiernej ilości ROS podczas wysiłku mogą prowadzić do upośledzenia kurczliwości mięśni szkieletowych i wywołać ich zmęczenie. Ponadto, powstający w wysiłku
•O2- w bezpośredniej reakcji może inaktywować tlenek azotu (NO) produkowany przez śródbłonek. Znacznie obniżona biodostępność NO z powodu zwiększonej produkcji  •O2- w wysiłku może prowadzić do przejściowej dysfunkcji śródbłonka. W związku z tym można przypuszczać, iż nadprodukcja ROS podczas zbyt intensywnego wysiłku zmniejszają wydolność wysiłkową.

Jednakże badania z udziałem ludzi i zwierząt nie potwierdzają tego, ponieważ suplemntacja antyoksydantami nie poprawia zdolności wykonania jednorazowego intensywnego wysiłku. Obecnie wiadomo, iż korzystne lub szkodliwe efekty biologiczne ROS nie są wynikiem jedynie ilości w jakiej powstają, ale również mogą być uzależnione od źródła ich produkcji w komórkach i tkankach, jak również rodzaju generowanej cząsteczki. Wydaje się, że jednym z głównych źródeł ROS i stresu oksydacyjnego w wysiłku jest zwiększona aktywność NADPH oksydaz (NOX) w śródbłonku, w którym aktywne są NOX1, NOX2, NOX4 i NOX5. Enzymy NOX obecne w śródbłonku głownie generują •O-. Wyjątkiem jest NOX4, który w przeciwieństwie do innych generuje H2O2. O2- produkowany przez NOX1, NOX2 i NOX5 inaktywuje bezpośrednio NO produkowany przez syntezę NO w śródbłonku (eNOS), co przyczynia się do dysfunkcji śródbłonka. Natomiast NOX4 przez produkcję H2O2 nie inaktywuje NO i jak wskazują dane literaturowe wydaje się pełnić rolę protekcyjną w układzie sercowo-naczyniowym.


Spektroskopia ramanowska w badaniach in vitro nad wychwytem molekuł przez komórki śródbłonka zatok wątroby

Kierownik: mgr Ewelina Matuszyk (Szafraniec)
Źródło finansowania: Narodowe Centrum Nauki, Program PRELUDIUM
Wnioskowane dofinansowanie: 201 600 PLN
Okres realizacji: 36 miesiące

Projekt obejmuje zastosowanie spektroskopii ramanowskiej do badania procesu wychwytu komórkowego (głównie na drodze endocytozy) zachodzącego w komórkach śródbłonka zatok wątroby (ang. Liver Sinusoidal Endothelial Cells, LSECs).

Celem projektu jest opracowanie metody analitycznej pozwalającej śledzić wychwyt molekuł oraz określenie kinetyki tego procesu, z wykorzystaniem wysokiej specyficzności oraz zdolności rozdzielczej techniki obrazowania ramanowskiego. Otrzymane rezultaty zostaną odniesione do wyników obrazowania mikroskopią fluorescencyjną, która posłuży jako technika referencyjna.

Kluczowym etapem projektu będzie walidacja opracowanej metody, polegająca na zahamowaniu wychwytu badanych substancji przez zastosowanie odpowiednich inhibitorów. Ten etap ma na celu potwierdzenie udziału znanych mechanizmów pośredniczących w wychwycie badanych substancji. Komórki LSEC charakteryzują się wysoką zdolnością endocytarną pozwalającą na oczyszczanie krwiz potencjalnie niebezpiecznych molekuł, równocześnie będąc istotnym ‘graczem’ w utrzymaniu homeostazy wątroby i odporności. Dysfunkcja komórek LSEC jest kluczowym momentemw rozwoju licznych dysfunkcji wątroby, mającym bezpośredni związek z utratą zdolności wychwytu molekuł z krwi, a tym samym upośledzenia procesu jej oczyszczania.


Spektroskopia rezonansowego rozproszenia ramanowskiego w badaniach in vitro i ex vivo adduktów hemoglobiny z gazotransmiterami

Kierownik: mgr Jakub Stanisław Dybaś
Źródło finansowania: Narodowe Centrum Nauki, Program PRELUDIUM
Wnioskowane dofinansowanie: 99 400 PLN
Okres realizacji: 24 miesiące

Śródbłonek naczyniowy, określany jako największy narząd wewnątrzwydzielniczy człowieka, produkuje i uwalnia liczne substancje wpływające na przeciwstawne procesy, zapewniające utrzymanie homeostazy naczyniowej. W przypadku zaburzenia tej równowagi dochodzi do dysfunkcji, opisywanej jako zaburzony rozkurcz oraz zwiększona przepuszczalność naczyń, czy upośledzenie właściwości naczynioprotekcyjnych śródbłonka. Procesy te są początkowym etapem wielu chorób, między innymi miażdżycy, nadciśnienia, niewydolności serca i innych patologii bezpośrednio niezwiązanych z układem sercowo-naczyniowym, takich jak np. przerzutowość nowotworowa. Z tego względu, nowym podejściem w leczeniu wymienionych schorzeń, staje się ukierunkowanie farmakoterapii na leczenie dysfunkcji śródbłonka. Badania przedkliniczne, badające skuteczność leczenia śródbłonka, wymagają jednak ciągłego rozwoju ze względu na brak rzeczywistych i solidnych metod oceny fenotypu śródbłonka naczyniowego w modelach zwierzęcych. Stosowane w warunkach klinicznych, nieinwazyjne metody oceny czynności śródbłonka nie sprawdzają się w warunkach eksperymentalnych, ze względu na wielkość badanych zwierząt (szczególnie myszy, stanowiących obecnie podstawowy model w badaniach przedklinicznych w biomedycynie) oraz częstotliwość pracy ich serca. Zatem powstaje potrzeba tworzenia nowych metod, które będą w stanie poradzić sobie z wymogiem wysokiej rozdzielczości czasowo-przestrzennej.

W niniejszym projekcie zdecydowano się na użycie nieinwazyjnej metody obrazowej opierającej się na zjawisku magnetycznego rezonansu jądrowego (MRI), charakteryzującą się wysoką czułości i powtarzalnością. Pomimo mniejszej dostępności, MRI stanowi doskonałe narzędzie pozwalające na wgląd w mechanizmy zależne od śródbłonka, zarówno w badaniach klinicznych jak i eksperymentalnych. Jednocześnie, metoda ta dostarcza wielu technik oraz możliwości wykorzystania środków kontrastowych, które pozwalają na badanie śródbłonka nawet u tak małych zwierząt jakimi są myszy.


W kierunku farmakologii doświadczalnej śródbłonka in vivo w oparciu o wieloparametrową metodę oceny czynności śródbłonka naczyniowego u myszy z wykorzystaniem technik obrazowania MR

Kierownik: mgr Anna Bar
Źródło finansowania: Narodowe Centrum Nauki, Program PRELUDIUM
Wnioskowane dofinansowanie: 99 900 PLN
Okres realizacji: 24 miesiące

Śródbłonek naczyniowy, określany jako największy narząd wewnątrzwydzielniczy człowieka, produkuje i uwalnia liczne substancje wpływające na przeciwstawne procesy, zapewniające utrzymanie homeostazy naczyniowej. W przypadku zaburzenia tej równowagi dochodzi do dysfunkcji, opisywanej jako zaburzony rozkurcz oraz zwiększona przepuszczalność naczyń, czy upośledzenie właściwości naczynioprotekcyjnych śródbłonka. Procesy te są początkowym etapem wielu chorób, między innymi miażdżycy, nadciśnienia, niewydolności serca i innych patologii bezpośrednio niezwiązanych z układem sercowo-naczyniowym, takich jak np. przerzutowość nowotworowa. Z tego względu, nowym podejściem w leczeniu wymienionych schorzeń, staje się ukierunkowanie farmakoterapii na leczenie dysfunkcji śródbłonka. Badania przedkliniczne, badające skuteczność leczenia śródbłonka, wymagają jednak ciągłego rozwoju ze względu na brak rzeczywistych i solidnych metod oceny fenotypu śródbłonka naczyniowego w modelach zwierzęcych. Stosowane w warunkach klinicznych, nieinwazyjne metody oceny czynności śródbłonka nie sprawdzają się w warunkach eksperymentalnych, ze względu na wielkość badanych zwierząt (szczególnie myszy, stanowiących obecnie podstawowy model w badaniach przedklinicznych w biomedycynie) oraz częstotliwość pracy ich serca. Zatem powstaje potrzeba tworzenia nowych metod, które będą w stanie poradzić sobie z wymogiem wysokiej rozdzielczości czasowo-przestrzennej.

W niniejszym projekcie zdecydowano się na użycie nieinwazyjnej metody obrazowej opierającej się na zjawisku magnetycznego rezonansu jądrowego (MRI), charakteryzującą się wysoką czułości i powtarzalnością. Pomimo mniejszej dostępności, MRI stanowi doskonałe narzędzie pozwalające na wgląd w mechanizmy zależne od śródbłonka, zarówno w badaniach klinicznych jak i eksperymentalnych. Jednocześnie, metoda ta dostarcza wielu technik oraz możliwości wykorzystania środków kontrastowych, które pozwalają na badanie śródbłonka nawet u tak małych zwierząt jakimi są myszy.

Celem projektu jest opracowanie i zwalidowanie czułej metodyki obrazowania in vivo pozwalającej na skuteczną ocenę zaburzeń śródbłonkowo-zależnej odpowiedzi naczyniorozkurczowej jak i przepuszczalności śródbłonka, które stanowią główne cechy jego dysfunkcji, a po drugie, zastosowanie opracowanej metodyki do oceny śródbłonkowych skutków farmakoterapii śródbłonka w mysim modelu miażdżycy, w którym spontanicznie rozwija się dysfunkcja śródbłonka.


W poszukiwaniu mechanizmów przeciwpłytkowego działania związków uwalniajacych CO: znaczenie kinetyki uwalniania CO, działania antyadhezyjnego i wpływu na metabolizm

Kierownik: mgr Barbara Maria Sitek
Źródło finansowania: Narodowe Centrum Nauki, Program PRELUDIUM
Wnioskowane dofinansowanie: 100 000 PLN
Okres realizacji: 24 miesiące

Celem projektu jest: zbadanie działania przeciwpłytkowego związków uwalniających CO (CORMs) o różnej naturze i kinetyce uwalniania CO, zbadanie wpływu CO-donorów na proces adhezji płytek krwi, z wykorzystaniem unikatowego systemu mikrowagi kwarcowej z systemem rozpraszania energii (Q-CMD) i nanoszczotek z sekwencją RGD, zbadanie wpływu związków uwalniających CO na metabolizm i bioenergetykę płytek krwi oraz wyjaśnienie czy mechanizmy przeciwpłytkowego działania związków uwalniających CO zależą od ich wpływu na bioenergetykę płytek krwi.

Realizacja  projektu  pozwoli  na  uzupełnienie  wiedzy  na  temat  działania  CO  na  proces  adhezji  i agregacji płytek krwi i pozwoli lepiej zrozumieć mechanizm działania CO-donorów. Opracowany model badawczy będzie można wykorzystać do rozwoju badań farmakologii płytek krwi, zarówno w stanach fizjologicznych, jak i patologicznych, co może znaleźć zastosowanie do poszerzania obecnie istniejącej wiedzy na temat patomechanizmów chorób cywilizacyjnych i do poszukiwania nowych, skuteczniejszych   niż   obecnie   metod   ich   leczenia.   Wyniki   badań   zostaną   opublikowane   w czasopismach naukowych oraz będą prezentowane na konferencjach w Polsce i za granicą, co pozwoli na ich rozpowszechnienie.


Biosensor oparty na aptamerach do jednoczesnego oznaczania trombiny i czynnika von Willebranda w osoczu

Kierownik: mgr Katarzyna Derszniak
Źródło finansowania: Narodowe Centrum Nauki, Program PRELUDIUM
Wnioskowane dofinansowanie: 149 940 PLN
Okres realizacji: 36 miesiące

Obecnie choroby cywilizacyjne stanowią duże wyzwanie dla dziedzin diagnostyki i farmakologii. Jednymi z najcięższych przypadłości są szeroko pojęte choroby nowotworowe. Obok nowotworów patologie układu krążenia jak np.: miażdżyca są również poważnym problemem klinicznym. W obu przypadkach istotne jest określenie czynników ryzyka, diagnoza choroby we wczesnym stadium i zastosowanie odpowiednio dobranej terapii. Dlatego też zasadne jest, iż poszukuje się zaawansowanych i precyzyjnych narzędzi diagnostycznych.

Okazuje się, że wykrywanie zaburzeń układu krzepnięcia może być czynnikiem prognostycznym zarówno dla rozwoju miażdżycy jaki i dla chorób nowotworowych. Trombina będąca kluczowym elementem układu krzepnięcia sprzyja rozwojowi powstającej blaszki miażdżycowej, zwiększa ryzyko incydentów zakrzepowo-zatorowych będących powikłaniem rozwijającej się miażdżycy. Może również stymulować proliferację komórek śródbłonka naczyniowego jak i komórek nowotworowych. Sprzyja również wewnątrznaczyniowemu wykrzepianiu oraz interakcjom komórka nowotworowa-płytka krwi. Ponadto, może sprawiać, że komórki śródbłonka stają się czulsze na działanie czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego VEGF (ang. Vascular Endothelial Growth Factor), co powoduje nasiloną mitozę komórek endothelium i ich migrację. Kolejnym dowodem na korelacje dysfunkcji układu krzepnięcia z chorobami nowotworowymi jest występowanie u pacjentów onkologicznych żylnej choroby zakrzepowo-zatorowej VTE (ang. Venous Thromboembolism). Jednym z identyfikowanych czynników ryzyka występowania VTE wśród pacjentów onkologicznych jest stan hiperkoagulacji, który wynika ze zwiększonej generacji trombiny. Ważnym składnikiem układu krzepnięcia obok trombiny jest czynnik von Willebranda, który aktywuje komórki śródbłonka sprzyjając rozwojowi zatorowości i przerzutów nowotworowych.

Dlatego opracowanie metody do badania funkcjonalego stanu układu zakrzepowego jest istotne dla oceny stopnia rozwoju choroby nowotworowej jak i patologii układu krążenia. Proponowanym rozwiązaniem jest biosensor, którego możliwości detekcyjne opierają się na wykorzystaniu aptamerów.


Badania bioanalityczne i farmakologiczne kompensacyjnych mechanizmów zależnych od MNA/COX-2/PGI2 w mysim modelu niedoboru tlenku azotu

Kierownik: mgr inż. Agnieszka Kij
Źródło finansowania: Narodowe Centrum Nauki, Program PRELUDIUM 9
Wnioskowane dofinansowanie: 99 992 PLN
Okres realizacji: 24 miesiące

Celem projektu jest zbadanie kompensacyjnej roli szlaku MNA/COX-2/PGI2 w toku rozwoju dysfunkcji śródbłonka i upośledzenia aktywności NO oraz zbadanie skutków farmakologicznej jego aktywacji na aktywność płytek krwi w mysim modelu niedoboru śródbłonkowego NO.

MNA (1-methylo-nikotynamid) podawany egzogennie wywołuje działanie przeciwzakrzepowe i przeciwzapalne przez mechanizmy zależne od COX-2/PGI2, a podwyższone stężenie endogennego MNA w przebiegu dysfunkcji śródbłonka towarzyszącej miażdżycy czy zapaleniu wątroby wskazuje na znaczenie kompensacyjne tej cząsteczki. Stawiamy hipotezę, że endogenny MNA jest regulatorem aktywności układu COX-2/PGI2 i stanowi istotny mechanizm kompensacyjny uruchamiany wobec upośledzenia wydzielania śródbłonkowego NO. Niniejszy projekt ma na celu zweryfikowanie tej hipotezy z wykorzystaniem mysiego modelu nadciśnienia wywołanego przez farmakologiczne zahamowanie syntezy NO. Zbadany zostanie wpływ niedoboru NO na zmiany aktywności szlaku MNA/COX-2/PGI2 w oparciu o pomiary stężenia MNA i jego metabolitów (2-Met-PY, 4-Met-PY), profilu eikozanoidów w osoczu i w moczu w odniesieniu do zmian aktywności płytek krwi, która będzie badana w oryginalnym eseju w pełnej krwi ex vivo. Badania przeprowadzone będą w toku rozwoju nadciśnienia wywołanego przez farmakologiczny niedobór NO, jak i po podaniu związków będących egzogennym źródłem MNA (MNACl) lub MNA i NO (MNANO2, MNANO3, c2913). Ważnym elementem tego projektu będzie opracowanie metody analizy ilościowej oznaczania wybranych eikozanoidów w moczu oraz w osoczu, a także przeprowadzenie walidacji metody.


Charakterystyka roli płytek krwi w procesie przerzutowania oraz ocena skuteczności leczenia przeciwpłytkowego na zahamowanie przerzutów w doświadczalnym modelu przerzutowości mysiego raka gruczołu sutkowego

Kierownik: mgr Elżbieta Buczek
Źródło finansowania: Narodowe Centrum Nauki, Program PRELUDIUM 8
Wnioskowane dofinansowanie: 99 980 PLN
Okres realizacji: 24 miesiące

Głównym celem niniejszego projektu jest zbadanie i charakterystyka roli płytek krwi w rozwoju przerzutów w płucach w doświadczalnym modelu przerzutowości nowotworowej mysiego raka gruczołu sutkowego 4T1 za pomocą trzech uzupełniających się metod badania płytek krwi: cytometrii przepływowej, oceny produkcji tromboksanu B2 w pełnej krwi, badania adhezji i agregacji płytek. Ponadto planowana jest ocena skuteczności leczenia przeciwpłytkowego na zahamowanie rozwoju przerzutów.

 


Przeciwzapalny efekt witaminy K: mechanizm działania

Kierownik: mgr Anna Kieońska-Rudek
Źródło finansowania: Narodowe Centrum Nauki, Program PRELUDIUM 16
Wnioskowane dofinansowanie: 210 000 PLN
Okres realizacji: 36 miesiące

Ostatnie badania pokazują, że funkcje witaminy K wykraczają poza kalcyfikacje i koagulacje obejmując również działanie przeciwzapalne. Wiadomo, że w procesach krzepnięcia i regulacji gospodarki wapniowej organizmu witamina K pełni funkcję kofaktora gamma karboksylazy w zależnej od witaminy K karboksylacji białek takich jak osteokalczyna czy czynniki krzepnięcia, podczas gdy molekularny mechanizm przeciwzapalnego działania witaminy K nie został jak dotąd wyjaśniony. Co więcej nasze wstępne badania na mysich makrofagach wskazują, że przeciwzapalne działanie witaminy K obejmuje szersze spektrum efektów niż do tej pory opisywano, co wskazuje, że witamina K reguluje wiele ścieżek w przebiegu stanu zapalnego.

W projekcie preludium dokonamy kompleksowej charakterystyki tych efektów przeciwzapalnych w makrofagach oraz zbadamy mechanizm tego działania wybranych członków witamin K (K1, K3, K2MK4, K2MK5, K2MK7, K2MK9) z uwzględnieniem: udziału karboksylacji zależnej od witaminy K, regulacji szlaku sygnałowego NFkB i wpływu na funkcje mitochondriów. 

Korzyści dla nauki w zakresie badań podstawowych przeprowadzonych w ramach tego projektu są następujące:
•  Zdefiniowanie przeciwzapalnego profilu działania szerokiej gamy powszechnie stosowanych i nowych przedstawicieli grupy witamin K (K1, K3, K2MK4, K2MK5, K2MK7, K2MK9).
•  Określenie wpływu powszechnie stosowanych antykoagulantów – inhibitorów witaminy K (warfaryny, acenokumarolu) na przeciwzapalne działanie witaminy K
•  Analiza proteomiczna obecności białek zależnych od witaminy K w subpopulacjach makrofagów M1 / M2
•  Charakterystyka szerokiego profilu zmian markerów zapalnych w odpowiedzi na leczenie witaminą K w subpopulacjach makrofagów M1 / M2
•  Kompleksowa ocena udziału karboksylacji w przeciwzapalnym działaniu witaminy K w makrofagach, w tym polaryzacja M1 /M2
•  Określenie zaangażowania szlaku sygnałowego NFkB w przeciwzapalne działanie witaminy K w makrofagach M1 / M2 • Określenie wpływu witaminy K na poprawę funkcji mitochondriów u makrofagów M1 / M2


Badanie układów biologicznie ważnych w warunkach wzmocnienia ramanowskiej aktywności optycznej

Kierownik: mgr Ewa Machalska
Źródło finansowania: Narodowe Centrum Nauki, Program PRELUDIUM 17
Wnioskowane dofinansowanie: 210 000 PLN
Okres realizacji: 36 miesiące

Celem projektu jest analiza struktury oraz chiralności biologicznie ważnych układów molekularnych jak również rozwój efektu rezonansowego wzmocnienia ramanowskiej aktywności optycznej, przy zastosowaniu konwencjonalnych metod spektroskopii optycznej tj.: spektroskopii ramanowskiej i absorpcyjnej UV-Vis; oraz zaawansowanych technik chiralooptycznych tj.: elektronowego dichroizmu kołowego (ECD) oraz ramanowskiej aktywności optycznej (ROA). Ważnym etapem w pełnej analizie otrzymanych wyników spektroskopowych jest ich porównanie z wynikami uzyskanymi w oparciu o podejście teoretyczne. Jednym z przedmiotów badań jest witamina B12, która ze względu na obecność 9-ciu centrów chiralnych w chromoforowym pierścieniu korynowym cechuje się silną chiralnością. W organizmach ssaków ta endogenna witamina jest przekształcana do metaloorganicznych kofaktorów: metylo- oraz adenozynokobalaminy, które pełnią istotne funkcje w procesach związanych z metabolizmem aminokwasów, syntezą nukleotydów i czerwonych krwinek. Stąd też, ważnym aspektem pracy jest szczegółowe zbadanie struktury i aktywności optycznej witaminy B12 tak, aby poprzez znalezienie zależności pomiędzy strukturą a chiralnością lepiej zrozumieć kluczową rolę tej cząsteczki w komórkach eukariotycznych. Kolejnym przedmiotem badań jest amfoterycyna B (AmB), która ze względu na swoją niezwykłą zdolność do tworzenia supramolekularnych agregatów, zarówno w błonach lipidowych, jak i układach modelowych, stanowi jeden z nielicznych przykładów pre-rezonansowego efektu ROA wywołanego procesem agregacji (ang. Pre-resonance Aggregation-Inducted Raman Optical Activity, pre-AIROA), będącego jedną ze strategii wzmocnienia słabego sygnału ROA.


Uszkodzenie glikokaliksu – pierwszy etap patomechanizmu dysfunkcji śródbłonka; pomiary z zastosowaniem elektroforezy kapilarnej

Kierownik: mgr Karolina Matyjaszczyk-Gwarda
Źródło finansowania: Narodowe Centrum Nauki, Program PRELUDIUM 16
Wnioskowane dofinansowanie: 139 447 PLN
Okres realizacji: 24 miesiące

Prawidłowa funkcja śródbłonka naczyniowego jest ściśle związana z prawidłową funkcją i budową glikokaliksu (GLX) -węglowodanowo-białkowej warstwy pokrywającej śródbłonek. Pojawia się coraz więcej dowodów na to, że uszkodzenie GLX wyprzedza rozwój jego dysfunkcji, czyli może być rozpatrywane jako pierwszy element patomechanizmu dysfunkcji śródbłonka.Jak dotąd, publikowane badania, przedstawiają tylko ułamek wiedzy o zmianach ilościowych i jakościowych w GLX, które zachodzą podczas rozwoju dysfunkcji śródbłonka. Dostępne metody służące do badania GLX mają swoje ograniczenia:mogą być zastosowane tylko dla tkanek ex vivo(immunohistochemia, mikroskopia sił atomowych), są oparte na analizie ilościowej tylko jednego ze składników GLX (metody immunoenzymatyczne np. ELISA), albo są niedostatecznie czułe. Według naszej wiedzy nie przeprowadzono do tej pory badań, które wyjaśniałyby jak poszczególne klasy glikozaminoglikanów (GAG) –polisacharydów będących jednym z budulców GLX, zachowują się podczas kolejnych etapów uszkodzenia GLX towarzyszących rozwojowi dysfunkcji śródbłonka. Przypuszczamy, że badanie stężeń w osoczu wszystkich klas GAG budujących GLX (siarczanu heparanu, heparyny, siarczanu dermatanu, siarczanu chondroityny, siarczanu keratanu) może pełniej oddać złożoność zachodzącego procesu uszkodzenia GLX orazw konsekwencji stać się czulszym biomarkerem stopnia zaawansowania degradacji GLX w stosunku do stosowanych obecnie(syndekan-1, siarczanheparanu, lub kwas hialuronowy).Wykorzystanie w proponowanym projekcie elektroforezy kapilarnej (CE) jest unikalnym podejściem, którepozwala na jednoczesne oznaczanienawet kilkudziesięciuróżnych cząsteczekGAG budujących GLX. Stosując metodę, opracowanąw oparciu o szczególne możliwości oferowane przez CEmożemy spodziewać się wyników, które odpowiedzą na pytanie, jak wyglądają pod kątem zmian w całym profilu GAG, kolejne etapy uszkodzenia GLX towarzyszące rozwojowi dysfunkcji śródbłonka. Rezultaty uzyskane z eksperymentów in vitroposłużą do opisania zmian w poszczególnym klasach GAG wywołanychwpływem bardziej lub mniej specyficznychenzymów uszkadzających GLX iokreśleniajakie zmiany w poziomach GAG są najbardziej charakterystyczne dla poszczególnych enzymów. Wzór ten posłuży jako podstawa do zbadania czy na poszczególnych etapach uszkodzenia GLX w modeluostrego uszkodzenia GLX invivoobserwowane zmiany w osoczu będą skorelowaneze zmianami reprezentatywnymi dla uszkodzenia konkretnej klasy GAG.Proponowany projekt, może stać się pierwszym krokiem w kierunku diagnozowania dysfunkcji śródbłonka na bardzo wczesnym etapie w oparciu odiagnostykę uszkodzenia GLX. Wykorzystanie CE, która jest techniką wysokoprzepustową i relatywnie tanią może wprowadzić nową jakość wśród dostępnych metod i stać się „złotym standardem” w rozpoznaniu wczesnego uszkodzenia śródbłonka naczyniowego.


Ocena porównawcza wpływu inhibitorów kinaz tyrozynowych (TKI) na funkcję śródbłonka in vivo u myszy

Kierownik: mgr Brygida Marczyk
Źródło finansowania: Narodowe Centrum Nauki, Program PRELUDIUM 17
Wnioskowane dofinansowanie: 209 900 PLN
Okres realizacji: 36 miesięcy

TKI blokują działanie kinaz tyrozynowych, które z kolei regulują wiele funkcji komórkowych, w tym sygnalizację komórkową oraz ich wzrost i podział. W niektórych typach komórek nowotworowych, enzymy te mogą być zbyt aktywne, prowadząc do ich gwałtownego wzrostu, co z kolei może być skutecznie hamowanie przez zastosowanie leków zawierających TKI.

Wprowadzenie TKI radykalnie zmieniło leczenie różnych nowotworów, w tym przewlekłej białaczki szpikowej (CML, chronic myeloid leukaemia). Niemniej jednak długotrwałe stosowanie TKI związane jest z niepożądanymi efektami naczyniowymi i prokoagulacyjnymi, co ma istotny wpływ na zachorowalność i śmiertelność pacjentów z powodu niekorzystnych zdarzeń naczyniowych. Pierwszym wprowadzonym TKI był imatynib, jednak ze względu na obserwowaną oporność na ten lek, wprowadzono TKI II generacji (nilotynib, dasatynib i bosutinib) oraz TKI III generacji (ponatynib). Podczas, gdy niepożądane działania naczyniowe obserwowano wielokrotnie w przypadku leczenia ponatynibem i nilotynibem, leczenie imatynibem uważa się za pozbawione istotnych niekorzystnych efektów naczyniowych i prozakrzepowych. Te obserwacje kliniczne sugerują odmienny efekt działania TKI na układ sercowo-naczyniowy, a w szczególności w śródbłonku naczyniowym.


Rola Angiotensyna (1-12) oraz szlaku niezależnego od ACE w produkcji Ang II w dysfunkcji sródbłonka naczyń obowodowych w niewydolności serca

Kierownik: mgr Tasnim Mohaissen
Źródło finansowania: Narodowe Centrum Nauki, Program PRELUDIUM 15
Wnioskowane dofinansowanie: 209 999 PLN
Okres realizacji: 36 miesiące

Niewydolność mięśnia sercowego (NS) jest poważnym problemem klinicznym oraz społecznym, na który cierpi ponad 26 milionów osób na całym świecie. Pomimo znacznego postępu medycyny liczba pacjentów z niewydolnością serca jednak stale wzrasta. Dysfunkcja śródbłonka naczyń jest uważana za cenny marker prognostyczny jak i diagnostyczny w NS, a jej scharakteryzowanie może stać się ważnym punktem uchwytu dla nowej farmakoterapii działającej na mechanizmy śródbłonkowe w naczyniach obwodowych w NS.Jedną z podstawowych grup leków stosowanych w leczeniu NS opierają się na blokowaniu układu Renina-Angiotensyna (RAS). Niestety terapia polegająca na ograniczeniu niekorzystnego działania Angiotensyny II (Ang II) w przebiegu NS łagodzi objawy choroby jedynie w części przypadków. Niepełna skuteczność tego leczenia może wynikać z faktu, iż u wielu pacjentów w trakcie terapii wciąż może dochodzić do nadmiernej produkcji Ang II, która wymyka się spod kontroli standardowej farmakoterapii, fenomen znany jako „Ang II escape”. Ang II będąca jednym z głównych czynników wywołujących dysfunkcję śródbłonka może powstawać nie tylko systemowo (Angiotensynogen-Renina-Angiotensyna I-Konwertaza angiotensyny (ACE)-Ang II) ale również lokalnie w naczyniach obwodowych w wyniku działania enzymów biorących udział w alternatywnych szlakach syntezy Ang II np. (Ang (1-12)-chymaza-Ang I-Ang II), które nie zostały w pełni poznane. Stąd też konieczne wydaje się lepsze zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw obwodowej dysfunkcji śródbłonka, w tym mechanizmów warunkujących zwiększoną lokalnie aktywność układu RAS. Szczególnie ważne jest poznanie substratów oraz enzymów, które są odpowiedzialne za alternatywne szlaki produkcji Ang II, niezależnejod ACE.

Celem projektu jest ocena fenotypu śródbłonka naczyń obwodowych na poziomie czynnościowym, biochemicznym oraz molekularnym, a także scharakteryzowanie alternatywnych szlaków syntezy Ang II (niezależnych od ACE) prowadzących do dysfunkcji śródbłonka naczyniowego we wczesnej, przejściowej oraz późnej fazie niewydolności mięśnia sercowego w mysim modelu tej choroby (myszy transgeniczne Tgαq*44).


Badanie wpływu wybranych właściwości fizykochemicznych na dystrybucję leków do komórek śródbłonka oraz wiązanie leków z białkami krwi

Kierownik: mgr Anna Agnieszka Gonciarz-Dytman
Źródło finansowania: Narodowe Centrum Nauki, Program PRELUDIUM 7
Wnioskowane dofinansowanie: 99 990 PLN
Okres realizacji: 24 miesiące

Celem projektu jest poszukiwanie zależności pomiędzy właściwościami fizykochemicznymi leków a stopniem ich wiązania się z białkami krwi oraz dystrybucją do śródbłonka. W planowanych badaniach wykorzystane będą leki naczynioprotekcyjne o ugruntowanej pozycji w leczeniu chorób układu sercowo-naczyniowego, mianowicie inhibitory konwertazy angiotensyny (ACE-I) oraz leki β- adrenolityczne (β-blokery, β-B). Dobór leków o zróżnicowanych właściwościach fizykochemicznych oraz zaznaczonej z różną siłą aktywności śródbłonkowej umożliwi określenie wpływu właściwości kwasowo- zasadowych oraz lipofilności badanych leków na ich dystrybucję do śródbłonka oraz wiązanie z głównymi białkami krwi. Wyniki badań pozwolą na lepsze zrozumienie czynników odpowiedzialnych za wiązanie leków z białkami krwi oraz dystrybucję. W szczególności planowane badania umożliwią odpowiedź na pytania na temat istniejących różnic w dystrybucji do śródbłonka zależności od lipofilności i właściwości kwasowo-zasadowych badanych leków. W efekcie końcowym planowane badania będą mogły wskazać, które z badanych właściwości fizykochemicznych mogą mieć wpływ na aktywność śródbłonkową.


Wpływ farmakokinetyki dwóch nowych hepato-selekytwnych NO-donorów V-PYRRO/NO i V-PROLI/NO na ich aktywność biologiczną w leczeniu eksperymentalnego modelu NAFLD u myszy

Kierownik: dr Kamil Kuś
Źródło finansowania: Narodowe Centrum Nauki, Program PRELUDIUM 6
Wnioskowane dofinansowanie: 99 985 PLN
Okres realizacji: 24 miesiące

Głównym celem niniejszego projektu jest pełna ocena profilu farmakokinetycznego dwóch nowych, hepatoselektywnych proleków uwalniających tlenek azotu (NO): V-PYRRO/NO oraz V-PROLI/NO, wywierających różne efekty farmakologiczne w mysim modelu NAFLD (niealkoholowe stłuszczenie wątroby). Badania wstępne prowadzone przez zespół badawczy JCET, wykazały że V-PYRRO/NO, lecz nie V-PROLI/NO, okazał się skuteczny w hamowaniu stłuszczenia wątroby, poprawiał wrażliwość na insulinę oraz modyfikował hepatotoksyczny profil lipidów w wątrobie. Na podstawie wyników tych badań przypuszczamy, że właściwości farmakokinetyczne obu związków mają znaczący wpływ na różny efekt farmakologiczny, dlatego też ich dokładne zbadanie pozwoli wytłumaczyć te różnice.

Szczegółowe cele badawcze projektu są następujące:

  1. optymalizacja metodyki, w tym opracowanie i zwalidowanie metody LC/MS/MS oznaczania badanych związków w różnych matrycach biologicznych
  2. określenie profilu farmakokinetycznego V-PYRRO/NO i V-PROLI/NO in vivo
  3. wyznaczenie parametrów eliminacji wątrobowej V-PYRRO/NO i V-PROLI/NO ex vivo
  4. badania metabolizmu V-PYRRO/NO i V-PROLI/NO w mikrosomach wątroby myszy oraz pierwotnych mysich hepatocytach in vitro
  5. wyjaśnienie różnic efektywności terapeutycznej V-PYRRO/NO i V-PROLI/NO, opierając się na wynikach badań farmakokinetycznych zaplanowanych w ramach przedstawianego projektu.

Obrazowanie „label-free” wewnątrzkomórkowych struktur śródbłonka za pomocą konfokalnej mikroskopii ramanowskiej oraz spektroskopii FT-IR, mikroskopii sił atomowych i mikroskopii fluorescencyjnej

Kierownik: dr Katarzyna Majzner
Źródło finansowania: Narodowe Centrum Nauki, Program PRELUDIUM 5
Wnioskowane dofinansowanie: 149 500 PLN
Okres realizacji: 36 miesięcy

Projekt zakłada opracowanie nowatorskiej metodyki z wykorzystaniem konfokalnej mikrospektroskopii ramanowskiej, spektroskopii absorpcyjnej w podczerwieni, mikroskopii sił atomowych (AFM) oraz mikroskopii fluorescencyjnej do równoczesnej oceny zmian wewnątrzkomórkowych na poziomie morfologicznym, biochemicznym oraz fizykochemicznym, ze szczególnym naciskiem na badanie tworzenia i roli ciałek lipidowych w śródbłonku.

Wiodącą metodą badawczą planowaną w projekcie jest spektroskopia ramanowska. Jest to podyktowane kilkoma czynnikami: 1. możliwością badania składu biochemicznego komórki na poziomie subkomórkowym w sposób czuły i niedestrukcyjny (możliwość badania żywych komórek), 2. możliwością szybkiej i jednoznacznej identyfikacji ciałek lipidowych w komórce w oparciu o unikalny „podpis” spektroskopy tych organelli, 3. łatwością uzyskania informacji o dystrybucji głównych komponentów biochemicznych z dużą rozdzielczością przestrzenną (do ca. 300 nm) z użyciem konfokalnego obrazowania ramanowskiego, co pozwala na rekonstrukcję 3D układu i śledzenie dystrybucji, kształtu i rozmiaru badanych struktur.


Od symptomów do leczenia: kompleksowa charakterystyka rozwoju zmian patologicznych w doświadczalnym modelu stłuszczenia wątroby za pomocą metod obrazowania spektroskopii oscylacyjnej

Kierownik: Kamila Kochan
Źródło finansowania: Narodowe Centrum Nauki, Program PRELUDIUM 5
Wnioskowane dofinansowanie: 116 400 PLN
Okres realizacji: 28 miesięcy

Głównym celem niniejszego projektu jest opracowanie profilu biochemicznego wątroby związanego z jej niealkoholowym stłuszczeniem oraz zbadanie zmian patologicznych towarzyszących mu na różnych etapach rozwoju w doświadczalnym modelu uszkodzenia wątroby, za pomocą nowoczesnych technik obrazowania spektroskopowego (FT – Raman, FT – IR). W szczególności, prezentowany projekt wiąże się z realizacją czterech celów. Pierwszym etapem jest (1) opracowanie metodyki pomiarowej badania stłuszczenia wątroby, zwłaszcza optymalnej preparatyki próbki do jednoczesnego obrazowania spektroskopowego i barwienia histochemicznego. Kolejne dwa zadania obejmują (2) charakterystykę zmian biochemicznych stłuszczonej wątroby w zaawansowanym stadium względem kontroli, za pomocą markerów spektralnych oraz (3) zbadanie rozwoju stłuszczenia wątroby (w oparciu o markery spektralne jej profilu biochemicznego) na jego wczesnych etapach. W ostatniej fazie projekt skupi się na (4) analizie wpływu leczenia hamującego stłuszczenie wątroby m.in. leków referencyjnych (np. metforminy) przez charakterystykę spektralną wątroby pobranej od osobników poddanych terapii w porównaniu do nieleczonych.


Spektroskopia oscylacyjna w poszukiwaniu biochemicznego odbicia patologii ściany naczyń krwionośnych we krwi zwierząt z nadciśnieniem tętniczym i płucnym

Kierownik: Emilia Staniszewska
Źródło finansowania: Narodowe Centrum Nauki, Program PRELUDIUM 5
Wnioskowane dofinansowanie: 99 750 PLN
Okres realizacji: 24 miesiące

Głównym celem projektu jest opracowanie metodyki i określenie całościowego profilu biochemicznego osocza i składników morfotycznych krwi w zwierzęcych modelach systemowego nadciśnienia tętniczego i nadciśnienia płucnego przy użyciu spektroskopii absorpcyjnej w podczerwieni (FTIR) oraz spektroskopii rozpraszania Ramana. Planowane badania i opracowana metodyka umożliwią rozwój nowej strategii prognozowania patologii ściany naczyń krwionośnych i zagrożeń z tym związanych na podstawie „odbicia”, jakie patologia ściany naczynia w nadciśnieniu wywołuje w profilu biochemicznym krwi widocznym w widmach oscylacyjnych.


Mała skala, wielkie znaczenie: spektroskopia ramanowska, obrazowanie 3D, mikroskopia sił atomowych i barwienie immunohistochemiczne w badaniach cukrzycy

Kierownik: Marta Pilarczyk
Źródło finansowania: Narodowe Centrum Nauki, Program PRELUDIUM 4
Wnioskowane dofinansowanie: 137 500 PLN
Okres realizacji: 33 miesiące

Głównym celem projektu jest opracowanie unikatowej wieloparametrowej metodyki oceny ściany naczynia z wykorzystaniem spektroskopii ramanowskiej, mikroskopii sił atomowych (AFM), barwienia immunohistochemicznego (IHC) oraz mikroskopii optycznej bliskiego pola (SNOM) do równoczesnej oceny ściany naczynia na poziomie morfologicznym, biochemicznym oraz fizykochemicznym. Celem projektu jest spektroskopowa analiza preparatów ściany naczynia krwionośnego w mysim modelu cukrzycy (db/db). Do poszukiwania różnic między osobnikami cukrzycowymi, a zdrowymi zostanie wykorzystana technika spektroskopii rozpraszania ramanowskiego z naciskiem na obrazowanie ramanowskie, również obrazowanie 3D skorelowana z innymi technikami: mikroskopii sił atomowych i barwienia immunohistochemicznego. Zaproponowane badania mają na celu wyznaczenie składu biochemicznego preparatów ściany naczynia, poznanie wpływu cukrzycy na skład biochemiczny i strukturę ścian naczyń, znalezienie różnic między tkanką zdrową a cukrzycową i określenie biochemicznych źródeł tych różnic.


Badania fizykochemiczne błony i środowiska wewnątrzkomórkowego śródbłonka

Kierownik: dr Aleksandra Jaworska
Źródło finansowania: Narodowe Centrum Nauki, Program PRELUDIUM 3
Wnioskowane dofinansowanie: 98 400 PLN
Okres realizacji: 24 miesiące (2013-2015), projekt zakończony 

Głównym celem projektu jest badanie spektroskopowe (jako główna metoda zastosowana będzie powierzchniowo wzmocniona spektroskopia Ramana, SERS) oraz fluorescencyjne (metoda referencyjna) fizykochemicznych właściwości komórek śródbłonka poprzez pomiary błony komórkowej oraz środowiska wewnątrzkomórkowego. Powyższe badania umożliwią badanie dystrybucji specyficznych białek funkcjonalnych występujących na błonie komórkowej (Selektyna P, L i E oraz ICAM-1 i VCAM-1), a także badanie pH i potencjału redox wewnątrz komórek. Planowane badania i opracowana metodyka umożliwią opis stanu czynnościowego zdrowych komórek śródbłonka oraz komórek śródbłonka stymulowanych przez TNFα, wywołujący ich stan zapalny. Planowana badania umożliwią opisanie różnic spektroskopowych pomiędzy prawidłowymi komórkami śródbłonka i komórkami śródbłonka aktywowanymi zapalnie.

Zaplanowane eksperymenty umożliwią lepsze poznanie komórek śródbłonka, których dysfunkcja, według doniesień literaturowych, powoduje rozwój chorób cywilizacyjnych (np. miażdżycy). Zastosowanie spektroskopii SERS w badaniach biochemicznych rozwija się bardzo szybko, jednak głównie w detekcji komórek rakowych (jednoznaczne rozróżnianie zdrowych i chorych komórek). W projekcie proponowane jest nowe podejście, kładące nacisk na równoczesne monitorowanie dystrybucji wielu protein na błonie komórkowej, które wraz z ‘mapą’ pH i potencjału redox wewnątrz komórek przyniesie bogaty opis fenotypu komórki zdrowej i umożliwi monitorowanie zmian podczas powstawania stanów chorobowych. Oczekiwane rezultaty nie będą miały bezpośredniej wartości aplikacyjnej, natomiast umożliwią rozwijanie techniki SERS jako metody badawczej komórek, co poszerzy dotychczasowy stan wiedzy w tej dziedzinie.


ETIUDA

Spektroskopia ramanowska w badaniu rozwoju niealkoholowego stłuszczenia wątroby z wykorzystaniem izolowanych komórek wątroby oraz modeli komórkowych in vitro

Kierownik: mgr Ewelina Matuszyk (Szafraniec)
Źródło finansowania: Narodowe Centrum Nauki, Program ETIUDA
Wnioskowane dofinansowanie: 201 600 PLN
Okres realizacji: 12 miesiące

 XXI wiek jest okresem zwiększonej zachorowalności na choroby cywilizacyjne związanez niezdrowym, siedzącym stylem życia. Wiele z tych zaburzeń jest związanych z dysfunkcją śródbłonka, wyścielającego wszystkie naczynia krwionośne. Dotyczy to również dysfunkcji wątroby takiej jak niealkoholowe stłuszczenie wątroby. Pomimo rosnącej zachorowalności, dokładny mechanizm powstawania i rozwoju tego schorzenia wciąż nie jest znany. Prowadzone prace skupiają się na poznaniu procesów związanych z tzw. wtórną dysfunkcją komórek śródbłonka zatok wątroby (ang. Liver Sinusoidal Endothelial Cells, LSECs), które to zdaje się mieć kluczowe znaczenie w rozwoju NAFLD i przyczyniać do dalszej progresji tego schorzenia w kierunku zapalenia i marskości wątroby.

W pracy zastosowano unikalne podejście polegające na badaniu izolowanych komórek wątroby pochodzących z mysiego modelu niealkoholowego stłuszczenia wątroby powstałego w wyniku stosowania diety wysokotłuszczowej. Kluczowym aspektem pracy jest znalezienie markerów spektroskopowych pozwalających stwierdzić pojawienie się dysfunkcji oraz śledzić jej rozwój w trakcie progresji choroby. W tym celu prowadzone badania zostały wykonane w na wczesnym(2 tygodnie żywienia dietą wysokotłuszczową) oraz późnym (15 i 20-ty tydzień) rozwoju stłuszczenia wątroby. Ponadto, celem pracy jest zgłębienie procesów wychwytu i metabolizmu lipidów w komórkach LSEC oraz hepatocytach. Spektroskopia ramanowska stała się cennym narzędziem w badaniach na poziomie komórkowym i subkomórkowym, umożliwiając wykrywaniei lokalizowania zmian biochemicznych zachodzących podczas rozwoju dysfunkcji, a także na badanie różnych procesów komórkowych. Zastosowanie tej techniki stwarza nowe możliwości badawczea zarazem, wzmacnia potencjał aplikacyjny metod spektroskopii oscylacyjnej.


MINIATURA

Charakterystyka spektroskopowa okołonaczyniowej tkanki tłuszczowej w progresji miażdżycy

Kierownik: dr Krzysztof Czamara
Źródło finansowania: Narodowe Centrum Nauki, Program MINIATURA
Wnioskowane dofinansowanie: 49 500 PLN
Okres realizacji: 12 miesięcy

W projekcie zaplanowano oryginalne badania tkanki tłuszczowej okołonaczyniowej PVAT mysiego modelu miażdżycy oraz tkanek tłuszczowych pacjentów chorych na miażdżycę. Celem projektu jest zdefiniowanie składu chemicznego PVAT oraz określenie zmian chemicznych w progresji miażdżycy za pomocą technik spektroskopii ramanowskiej, w tym z zastosowaniem ramanowskich sond światłowodowych. Miażdżyca naczyń jest procesem dość dobrze poznanym w kontekście wpływu warstwy śródbłonka na jej patogenezie, jednakże ostatnie odkrycie parakrynnego oddziaływania PVAT otwiera nowe pole badań tej choroby. Obrany kierunek badań wydaje się być interesującym, a zarazem punktem wyjścia do przyszłej, wczesnej diagnostyki miażdżycy, zmierzającej do zapobiegania i leczenia chorób naczyniowych. Badania tego typu mogą przyczynić się także do zrozumienia mechanizmów działania PVAT na ścianę naczyń krwionośnych.


Rola PGI2 oraz NO, wytwarzanych przez komorki śródbłonka zatok wątroby (LSEC), w regulacji glikogenolizy i glukogenogenezy w wątrobie na wczesnym etapie rozwoju NAFLD – badania z zastosowaniem unikatowego systemu izolowanej perfundowanej wątroby

Kierownik: dr inż. Izabela Czyżyńska-Cichoń
Źródło finansowania: Narodowe Centrum Nauki, Program MINIATURA
Wnioskowane dofinansowanie: 49 500 PLN
Okres realizacji: 12 miesięcy

Celem projektu jest zbadanie udziału prostacykliny (PGI2) i tlenku azotu (NO) produkowanych przez komórki śródbłonka zatok wątroby (LSEC) w parakrynnej regulacji glikogenolizy oraz glukoneogenezy w wątrobie na wczesnym etapie rozwoju niealkoholowej stłuszczeniowej choroby wątroby (NAFLD). Badania mają pomóc w znalezieniu odpowiedzi na pytania: czy mediatory produkowane przez LSEC mogą regulować metabolizm glukozy w hepatocytach oraz czy w toku rozwoju NAFLD dochodzi do zmian regulacji metabolizmu glukozy zależnego od LSEC i czy ta dysfunkcja ma charakter pierwotny czy wtórny? Podstawą realizacji projektu będzie unikatowa metodyka badań ex vivo z wykorzystaniem izolowanej perfundowanej wątroby, umożliwiająca biochemiczne oraz czynnościowe profilowanie narządu z zachowaniem jego integralności, ale z pominięciem wpływu innych tkanek.


Zmiany w parakrynnej sygnalizacji komórek śródbłonka zatok wątroby pod wpływem kwasów tłuszczowych, a tworzenie kropli lipidowych w hepatocytach- zastosowanie platformy do badań trójwymiarowych hodowli komórkowych w mikroprzepływie, OrganoPlate®

Kierownik: dr inż. Edyta Kuś
Źródło finansowania: Narodowe Centrum Nauki, Program MINIATURA
Wnioskowane dofinansowanie: 49 995 PLN
Okres realizacji: 12 miesięcy

Projekt dotyczy zbadania wpływu kwasów tłuszczowych na zmianę parakrynnej sygnalizacji komórek śródbłonka zatok wątroby (LSEC) oraz jej udział w tworzeniu kropli lipidowych w hepatocytach. Badania będą realizowane z wykorzystaniem platformy OrganoPlate® umożliwiającej odzwierciedlenie środowiska fizjologicznego wątroby tj. zapewnienie warunków statecznych w macierzy zewnątrzkomórkowej dla hepatocytów oraz kontrolowanego mikroprzepływu dla LSEC przy równoczesnym zachowaniu ciągłej komunikacji między komórkami. Realizacja projektu ma na celu lepsze zrozumienie roli LSEC w rozwoju stłuszczenia wątroby.


Wpływ wisfatyny na bioenergetykę i fenotyp komórek śródbłonka

Kierownik: dr Łukasz Mateuszuk
Źródło finansowania: Narodowe Centrum Nauki, Program MINIATURA
Wnioskowane dofinansowanie: 42 711 PLN
Okres realizacji: 12 miesięcy

Projekt dotyczy zewnątrzkomórkowego metabolizmu nowych substratów syntezy NAD+ w liniach komórek śródbłonka; w szczególności udziału wisfatyny i CD73 w działaniu rybozydu nikotynamidu oraz mononukleotydu nikotynamidu na bilans energetyczny i wygaszanie szlaków prozapalnych.


Badanie molekularnych mechanizmów metastazy w mysim modelu raka gruczołu sutkowego poprzez kompleksową ocenę zmian w ekspresji białek w płucach

Kierownik: dr Anna Katarzyna Kurpińska
Źródło finansowania: Narodowe Centrum Nauki, Program MINIATURA
Wnioskowane dofinansowanie: 49 500 PLN
Okres realizacji: 12 miesięcy

Nowotwór piersi charakteryzuje się dużą zdolnością do przerzutowania, szczególnie do płuc, a w konsekwencji wysoką śmiertelnością.

Mimo znacznego postępu zarówno w diagnostyce jak i leczeniu, wciąż nie w pełni poznane mechanizmy powstawania nowotworu i metastazy stanowią barierę w doborze skutecznych, selektywnych leków. Niewiele jest prac dotyczących definiowania potencjału metastatycznego i charakterystyki stricte procesu metastazy. Tymczasem, dogłębne poznanie procesów związanych z progresją nowotworową pozwoli na charakterystykę czynności, chorobowo zmienionych narządów, jak również może być pomocne w odpowiedzi na pytanie w jaki sposób wybierane jest miejsce tworzenia się guzów wtórnych.

Celem projektu jest zbadanie mechanizmów leżących u podstaw dysfunkcji płuc w przebiegu progresji nowotworowej poprzez poszukiwanie biomarkerów formowania niszy metastatycznej w płucach oraz wskazanie, które ścieżki metaboliczne ulegają znacznej deregulacji w późnych stadiach rozwoju nowotworu.

Aplikacja technik proteomicznych pozwoli na poszerzenie wiedzy z zakresu metastazy nowotworu piersi, charakterystykę molekularnych mechanizmów oraz poznanie sieci zależności i mechanizmów adaptacji w rozwoju i przebiegu metastazy. Zmiany zaobserwowane na poziomie białek mogą okazać się pomocne we wskazaniu potencjalnych celów terapeutycznych dla selektywnych leków.


Zastosowanie nowej techniki immunohistochemicznego obazowania pułapki spinowej DMPO do obrazowania stresu oksydacyjnego w mięśniu sercowym u myszy

Kierownik: dr Bartosz Jacek Proniewski
Źródło finansowania: Narodowe Centrum Nauki, Program MINIATURA
Wnioskowane dofinansowanie: 49 995 PLN
Okres realizacji: 12 miesięcy

Reaktywne formy tlenu pełnią role przekaźnikowe w warunkach fizjologicznych, jednak w stanach zapalnych i patologiach dochodzi do deregulacji ich produkcji i mechanizmów obronnych, stanu określanego jako stres oksydacyjny. Efekty stresu oksydacyjnego są klinicznie obserwowalne w niewydolności serca, a wcześniejsze badania potwierdziły, że w mysim modelu Tgαq*44 dochodzi do zwiększonej produkcji rodnika ponadtlenkowego (O2-•). Metody wykorzystywane w dotychczas prowadzonych badaniach stresu oksydacyjnego są albo niespecyficzne (metody fluorescencyjne), albo wymagają homogenizowanych próbek, uniemożliwiając określenie lokalizacji. Co ważne w literaturze często sam fakt podwyższonej produkcji wolnych rodników (np. rodnika ponadtlenkowego) jest utożsamiany z obecnością stresu oksydacyjnego, podczas gdy z definicji jest to stan, w którym produkcja wolnych rodników przewyższa możliwości ich neutralizacji przez enzymy antyoksydacyjne.

Wykorzystanie w badaniu techniki immunohistochemicznego obrazowania pułapki spinowej DMPO (IST) do analizy stresu oksydacyjnego w mięśniu sercowym u myszy, dzięki wysokiej reaktywności pułapki spinowej DMPO wobec rodników białkowych/lipidowych i zastosowaniu specyficznych przeciwciał anty-DMPO, umożliwiło wizualizację oksydacyjnych zmian w obrębie serca u myszy transgenicznych Tgαq*44, u których występuje niewydolność serca, związana z nadekspresją białka Gαq w kardiomiocytach. Wykazano, że zmiany te pojawiają się dużo później, niż ma miejsce zwiększona produkcja rodnika ponadtlenkowego, ale równolegle do pierwszych funkcjonalnych symptomów niewydolności serca, badanych metodami in vivo (USG/MRI). Dzieje się tak za sprawą skutecznych mechanizmów antyoksydacyjnych, które ulegają aktywacji w mięśniu sercowym w badanym modelu. Wyniki wskazują, że metoda IST faktycznie pokazuje „efekt końcowy” niezbalansowanego stresu oksydacyjnego, w odróżnieniu od jedynie pomiarów opartych o detekcję wolnych rodników, bez równoległej oceny aktywności enzymatycznej szlaków antyoksydacyjnych.

Fluorescencyjna, obrazowa detekcja adduktów DMPO w przekrojach mięśnia sercowego umożliwiła ponadto określenie części serca najbardziej dotkniętych zmianami oksydacyjnymi, którymi okazały się ściany komór, w szczególności lewej komory. Co więcej, dzięki zastosowaniu dodatkowego barwienia śródbłonka przy pomocy lektyny w obrębie mięśnia sercowego wykazano, że także on ulega zmianom oksydacyjnym w badanym modelu Obserwacja ta dotyczy zarówno dużych naczyń, jak i kapilar znajdujących się pomiędzy kardiomiocytami. Oksydacyjne zmiany śródbłonka oznaczają, że musi istnieć mechanizm propagacji stresu oksydacyjnego z kardiomiocytów, w których ma on swój początek za sprawą zmodyfikowanego białka Gq, do śródbłonka, a jego identyfikacja i farmakologiczna modyfikacja mogą przyczynić się do opracowania nowych, skutecznych szlaków terapeutycznych w niewydolności serca.


Szlak PGI2/SIRT1 szansą na zrewolucjonizowanie farmakoterapii w leczeniu chorób układu krążenia

Kierownik: dr Magdalena Sternak
Źródło finansowania: Narodowe Centrum Nauki, Program MINIATURA
Wnioskowane dofinansowanie: 49 500 PLN
Okres realizacji: 12 miesięcy

Sirtuina 1 (SIRT1) odgrywa kluczową rolę w funkcjonowaniu śródbłonka. Przypisuje się jej udział w uruchamianiu mechanizmów naprawczych w dysfunkcji śródbłonka. Celem zaplanowanych badań w projekcie jest zbadanie udziału prostacykliny PGI2 w mechanizmach obronnych współzależnych z aktywnością SIRT1, w poprawie funkcjonowania śródbłonka naczyniowego w mysim modelu transgenicznym (endothelial CDK5R1 (EC-p25) z nadekspresją białka EC-p25. Jest to unikatowy model, gdzie białko ECp25 tworzy kompleks z cyklinozależną kinazą 5CDK5, którego nadmiar wywołuje hiperfosforylację SIRT1 przyczyniając się do indukowania dysfunkcji śródbłonka.

Wiedza uzyskana w ramach projektu pozwoli na kontynuację badań w kierunku farmakologii sirtuin w oparciu o endogenny mediator śródbłonka tj.PGI2, który może być traktowany w przyszłości jako potencjalny terapeutyczny cel dla selektywnych leków oddziałujących na SIRT1. 


Wieloparametrowa ocena dysfunkcji śródbłonka płucnego w toku rozwoju choroby nowotworowej w mysim modelu raka piersi

Kierownik: dr Marta Maria Smęda
Źródło finansowania: Narodowe Centrum Nauki, Program MINIATURA
Wnioskowane dofinansowanie: 49 280 PLN
Okres realizacji: 12 miesięcy

W projekcie Pani dr Marty Smędy planowane jest dokonanie wieloparametrowej oceny progresji dysfunkcji śródbłonka płucnego w toku rozwoju raka piersi po ortotopowym i dożylnym podaniu komórek nowotworowych.Przeprowadzenie planowanych badań pozwoli na poszerzenie wiedzy z zakresu mechanizmów regulujących przerzutowanie zależnych od śródbłonka naczyniowego, oraz na znalezienie parametru, który najlepiej będzie dyskryminował dysfunkcję śródbłonka naczyniowego w płucach w premetastatycznej fazie choroby. Może to stanowić punkt wyjścia dla badań nad poszukiwaniem efektywnej farmakoterapii i podjęcia próby ograniczenia przerzutowania do płuc poprzez poprawę/utrzymanie funkcji śródbłonka naczyniowego w tym narządzie.


W kierunku farmakologii adhezji i transmigracji komórek nowotworowych z wykorzystaniem unikatowych platform mikroprzepływowych 3D

Kierownik: dr Marta Stojak
Źródło finansowania: Narodowe Centrum Nauki, Program MINIATURA
Wnioskowane dofinansowanie: 45 100 PLN
Okres realizacji: 12 miesięcy

Działaniem naukowym przewidzianym do realizacji w ramach projektu MINIATURA 1 był wyjazd na staż do laboratorium Profesora Christophera C. W. Hughesa (Department of Molecular Biology and Biochemistry, University of California, Irvine, USA), twórcy unikatowej metodyki wykorzystania platform mikroprzepływowych 3D (VMT, vascularized microtumors) w celu opanowania, a w dalszej perspektywie rozwinięcia pionierskiej metodyki do badań farmakologii śródbłonka w przerzutowości nowotworowej. Podstawowym problemem w zrozumieniu zachowania komórek nowotworowych w interakcji z śródbłonkiem jest aktualnie brak dobrych modeli in vitro. Obecne modele stawiają na prostotę i wygodę, ignorując złożoność unikatowego mikrośrodowiska nowotworu. W laboratorium Profesora Hughesa opracowano innowacyjny system mikrofizjologiczny, łączący w sobie trójwymiarowy układ komórek z układem naczyniowym, który zapewnia fizjologiczny przepływ oraz transport składników odżywczych i metabolitów. Ponadto platforma VMT jest przezroczysta, co pozwala na nieinwazyjne obrazowanie tkanek czy komórek. Wszystko to razem sprawia, że urządzenia VMT mają ogromny potencjał i przewagę nad innymi komercyjnie dostępnymi urządzeniami mikroprzepływowymi jak również na klasycznym układem stosowanym przeze mnie w dotychczasowych badaniach.


Wpływ aktywatorów czynnika transkrypcyjnego Nrf2 na przepuszczalność komórek śródbłonka — badania ex vivo z wykorzystaniem myszy knockoutowych B6.129X1-Nfe2l2tm1Ywk/J 3D

Kierownik: dr Ewa Szczęsny-Małysiak
Źródło finansowania: Narodowe Centrum Nauki, Program MINIATURA 3
Wnioskowane dofinansowanie: 49 500 PLN
Okres realizacji: 12 miesięcy

Celem badań zaplanowanych do realizacji w projekcie jest zbadanie udziału aktywacji czynnika transkrypcyjnego Nrf2 w zmianach przepuszczalności komórek śródbłonka aorty (będącej miarą dysfunkcji śródbłonka). Planowane eksperymenty zostaną wykonane ex vivo na naczyniach krwionośnych pobranych od myszy knockoutowych B6.129X1-Nfe2l2tm1Ywk/J Nrf2 charakteryzujących się upośledzoną zdolnością ekspresji czynnika Nrf2 oraz myszy typu dzikiego C57BL/6J. Naczynia krwionośne zostaną uprzednio poddane działaniu leków- aktywatorów czynnika Nrf2: Bardoxolonu metylu, fumaranu dimetylu i L-sulforafanu. Wykazanie różnic w działaniu poszczególnych substancji pozwoli stwierdzić, czy obserwowane efekty są zależne od aktywacji Nrf2, czy też konieczne będzie określenie innego molekularnego mechanizmu zachodzących zjawisk.


facebook JCET